Studies on Selective Maker Gene-Free Transplastomic Rice for Transglutaminase Production

水稻是台灣重要的農作物之一，其栽培面積十分廣大。但因栽培成本不斷提高，使得種植水稻之經濟效益相對降低。加上台灣加入世界貿易組織，市場開放，水稻的經濟價值面臨重大的壓力。因此，除了研究降低生產成本之外，提高水稻生產之附加價值，利用水稻當作生物反應器來生產高經濟價值生產工業、食品、飼料及醫藥方面的產品，成為另一個提升水稻價值之有效途徑。 轉穀氨醯胺酵素 (Transglutaminase, TGA)催化蛋白質分子內與分子間ε-(γ-glutamyl) lysine共價鍵之生成，使蛋白質分子間形成架橋而成三次元結構，使蛋白濃縮液形成膠體化，因此在食品加工上有相當高的應用價值及潛力。在魚肉、畜肉、大豆、小麥、乳品、蛋等可改善彈性、質地、口感、風味，並可增加儲存壽命。因此在食品加工上有相當高的應用價值及潛力。目前TGA大多自動物肝臟中分離純化取得，因含量不高及來源獲得不易或純化過程複雜，無法大量生產，因此限制了其在食品加工上之應用。 植物葉綠體基因轉殖具有：增加轉殖基因大量表現，不會造成基因污染、基因靜寂及插入位置效應，較細胞核基因轉移穩定等優點；因此開發葉綠體基因轉殖技術為近代生物技術的主力研發工作。本研究將轉穀氨醯胺酵素基因(tga)轉移至水稻之葉綠體中，探討利用無篩選標誌基因的水稻葉綠體為生物反應器，生產轉穀氨醯胺酵素的可行性，以提高水稻經濟效益。 本研究已將自放線菌Streptomyces netropsis中篩選出的轉榖氨醯胺酵素基因(tga)，所構築到水稻葉綠體基因轉殖之六種載體，pMT92EP-sA、pMT92EP-sD、pMT92EP-sR、pMT92GP-sA、pMT92GP-sD及pMT92GP-sR，利用基因槍法轉殖到''台農67號''水稻之癒傷組織的葉綠體。培殖體經50~100ppm D-alanine或100ppm streptomycin持續篩選及誘導再生，目前已獲得再生植株。將再生植株葉片以PCR及RT-PCR分析之結果顯示，tga基因已存在於轉殖之水稻植株的葉綠體基因組中，並表現tga mRNA而篩選標誌基因daao、AlaR及aada則沒有偵測到。初步的結果顯示利用剔除標誌基因的水稻葉綠體基因轉殖系統，以水稻葉綠體為生物反應器，生產轉穀氨醯胺酵素是可行的。Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important and most widely cultivated crops in Taiwan. However, because the cost of cultivation is increasing every year, and the strong competition of imported rice from other countries after joining the WTO, the economic value of rice growing is downsizing. In addition to reduce the production cost, useing rice plants as bioreactors to produce industrial, feed and fodder additives, and pharmaceutical proteins becomes a new way for increasing economic values of rice and may solve the problems we are facing. Transglutaminase (TGA) catalyses an acyl-transfer reaction in which the γ-carboxamide groups of peptide-bound glutaminyl residues are the acyl donors. The enzyme catalyses in vitro cross-linking in whey proteins, soya proteins, wheat proteins, beef myosin, casein and crude actomyosin refined from mechanically deboned poultry meat. In recent years, on the basis of the enzyme''s reaction to gelatinize various food proteins through the formation of cross-links, this enzyme has been used in attempts to improve the functional properties of foods. Up to now, commercial TGA has been merely obtained from animal tissues. The complicated separation and purification procedure results in an extremely high price for the enzyme, which hampers a wide application in food processing. Expression of foreign genes via chloroplast genomes is not only dramatically enhances the level of expression without epigenetic effects, but also prevents out cross of the introduced foreign genes via pollen grains. Thus, transformation of the plastid genome is a new and attractive alternative to engineering the nuclear genome. Chloroplast transformation vectors contain a selective marker, most commonly a spectinomycin resistance gene (aadA). Possible problems associated with plastid marker genes are the metabolic burden imposed by high-level expression and the potential for the unlikely event of horizontal transfer to microbes. The objective of this study is to develop the selective maker gene-free transplastomic rice as bioreactor to overproduce transglutaminase. In this study, the tga genes isolated fromStreptomyces netropsis and construced transplastomic vectors, namely pMT92EP-sA, pMT92EP-sD, pMT92EP-sR, pMT92GP-sA, pMT92GP-sD, and pMT92GP-sR, were transferred into the rice (Oryza sativa L. cv. Tinung 67) plastids via particle gun mediated transformation.The regenerated plantlets were primary selected by 50~100 ppm D-alanine or 100 ppm spectinomycin and further confirmed by PCR. The results of PCR and RT-PCR analyses indicated that the tga gene is present in the chloroplast genome of transplastomic rice and expressed tga mRNA, while selective marker genes, daao, AlaR, and aada, were not detectable in the transplastomic rice. Our results indicated that it’s possible to overproduce the transglutaminase through the art of biotechnology of transplastomic rice with selective maker gene-free.目 次 前言……………………………………………………………………… 1 前人研究………………………………………………………………… 4 一、葉綠體基因轉殖技術……………………………………………… 4 二、葉綠體作為生物反應器之研究概況……………………………… 5 三、篩選標誌基因在基因轉殖植物的應用與發展……………………8 四、移除基因轉殖植物之篩選標誌基因………………………………10 五、穀氨醯胺酵素………………………………………………………14 材料與方法………………………………………………………………16 結果………………………………………………………………………23 一、轉殖載體分析………………………………………………………23 二、篩選藥劑對水稻種子生長與發育的影響…………………………23 三、建立水稻基因槍法轉殖系統………………………………………24 四、誘導水稻癒傷組織、基因槍轉殖、篩選及再生水稻植株………25 五、轉殖再生水稻植株之基因及表現分析……………………………25 討論…………………………………………………………………… 47 參考文獻……………………………………………………………… 49 圖一、水稻葉綠體轉殖載體pMT92EP-sA、pMT92EP-sD及 pMT92EP-sR之基因圖譜…………………………………………………27 圖二、水稻葉綠體轉殖載體pMT92GP-sA、pMT92GP-sD及 pMT92GP-sR之基因圖譜…………………………………………………28 圖三、以限制酵素XbaI切割，檢測六種水稻葉綠體轉殖載體的正確性…29 圖四、以PCR檢測水稻葉綠體轉殖載體上之AlaR、gus、egfp基因的 正確性………………………………………………………………………30 圖五、以PCR檢測水稻葉綠體轉殖載體之aadA、daao、tga基因的 正確性………………………………………………………………………31 圖六、D-alanine、kanamycin、streptomycin、spectinomycin與 G418等藥劑對水稻種子生長與發育的影響……………………………32 圖七、五種不同篩選藥劑D-alanine、kanamycin、streptomycin、 spectinomycin與G418處理，對水稻種子發芽率之影響……………33 圖八、五種不同篩選藥劑D-alanine、kanamycin、streptomycin、 spectinomycin與G418處理，對水稻幼苗鮮重之影響…………………34 圖九、五種不同篩選藥劑D-alanine、kanamycin、streptomycin、 spectinomycin與G418處理，對水稻幼苗根生長之影響………………35 圖十、五種不同篩選藥劑D-alanine、kanamycin、streptomycin、 spectinomycin與G418處理，對水稻幼苗芽梢生長之影響……………36 圖十一、亞精胺及魚精蛋白對載體DNA披覆在金粒子表面之影響…………37 圖十二、葉綠體轉殖水稻癒傷組織及對照組進行GUS活性染色 分析之情形………………………………………………………………38 圖十三、̒台農67號’水稻之成熟種子誘導癒傷組織、經基因槍轉移基因、 篩選及誘導再生植株之情形……………………………………………39 圖十四、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子11、12進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析tga基因的情形……40 圖十五、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子3、4進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析egfp基因的情形……41 圖十六、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子1、2進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析gus基因的情形……42 圖十七、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子9、10進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析aadA基因的情形…43 圖十八、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子7、8進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析daao基因的情形……44 圖十九、以擬轉殖水稻的葉片DNA為模板，使用核酸引子5、6進行 聚合酵素鏈鎖反應之產物，以電泳膠片分析AlaR基因的情形……45 圖二十、以擬轉殖植株的葉片 RNA反轉錄之cDNA為模板，使用核酸 引子11、12，進行聚合酵素鏈鎖反應分析tga mRNA的情形……4