The crucial role of Arg106 in RNA-binding of human coronavirus OC43 nucleocapsid protein

冠狀病毒 (coronavirus) 為正股RNA病毒，其宿主包括多種哺乳類及鳥類，且病毒感染後的宿主易引起多種呼吸道及腸道疾病。人類冠狀病毒OC43 (HCoV-OC43)主要會引起人類普通的感冒。HCoV-OC43分屬於冠狀病毒第二型，其核殼蛋白 (nucleocapsid protein, N protein) 會與病毒的單股RNA包裹成長鏈螺旋狀的核糖核酸蛋白複合體 (ribonucleoprotein, RNP)，再包裝入蛋白質套膜，進而組裝完成病毒顆粒。核殼蛋白是冠狀病毒中數量最多的結構蛋白，其N端功能區域 (N-terminal domain) 為主要的RNA結合區域，且在不同冠狀病毒中皆具保留性。本篇探討HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區與RNA之結合機制，首先，以X-ray繞射結晶法解析出HCoV-OC43核殼蛋白的N端功能區結構，N端功能區主要由β-sheet組成結構之核心，由β-sheet核心延伸出一段disordered的loop，此loop上鹼性胺基酸含量高，為可能的RNA結合位。將HCoV-OC43與相關冠狀病毒之N端功能區結構重疊 (superimpose) 後發現HCoV-OC43的鹼性胺基酸Arginine 106 (R106) 與其他相關冠狀病毒相對位置的Arg具結構上的保留性 (structural conservation)。為探討核殼蛋白R106與RNA結合的分子機制，藉由定點突變 (site-directed mutagenesis) 將R106突變成Lysine (R106K)、Glutamic acid (R106E)、Glutamine (R106Q)、Methionine (R106M)、Alanine (R106A) 等胺基酸後，利用螢光光譜儀分析結果可得知，野生型及突變型核殼蛋白在三級結構上並沒有發生顯著的差異；從表面薄膜共振技術 (surface plasmon resonance, SPR) 的實驗結果得知，相較於野生型 (wild type, WT) 核殼蛋白，帶正電荷胺基酸的R106K在結合能力與解離常數上與WT無顯著差異；R106Q的RNA親和力 (RNA-binding affinity) 較WT約減少60％；另外，R106E、R106M各為帶負電荷及帶斥水性側鏈 (hydrophobic side chain) 的胺基酸，其RNA親和力較WT約減少兩倍；R106A的RNA親和力則最低。由以上實驗證實R106的正電荷胺基酸特性對於核殼蛋白與RNA結合的確具有其重要性。本篇論文主要探討核殼蛋白R106與RNA結合的分子機制，希望有助於進一步的了解HCoV-OC43核殼蛋白的RNA結合機制。Coronaviruses (CoVs) harbor very large positive sense RNA genomes and cause a range of upper and lower respiratory tract infections in both veterinary animals and humans. Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43), a membrab of group Ι coronaviruses, is one of the causes of the “common cold” in human during seasons of cold weather. Nucleocapsid protein, the major structural protein of CoVs, binds to the viral RNA genome to form the virion core, which leads to the formation of a ribonucleoprotein (RNP) complex or to a long helical nucleocapsid structure. The N-terminal domain of coronaviral N proteins (N-NTD) provides a scaffold for RNA binding. The structure of HCoV-OC43 N-NTD was determined in hexagonal lattices to 1.7 Å. HCoV-OC43 N-NTD (residues 58 to 195), with its single-domain β-sheet core and large loops on the outside, is similar in overall topology to SARS crystal structures (residues 47 to 175) and to the two IBV crystal structures (residues 29 to 160). The most dramatic difference between OC43 N-NTD and SARS N-NTD or IBV N-NTD is in the positively charged loop (residues 104 to 122), implicated in RNA binding, which is disordered in OC43 N-NTD. The positively charged loop of OC43 N-NTD has a well structural-conserved positive residue, Arg106 that was noticed with its positively charged chain possibly to interact with a nucleotide base. To probe the role of Arg106 involved in RNA-binding of HCoV-OC43 N protein, we were undertaking a series of site-directed mutagenesis to replace Arg106 by lysine (R106K), glutamic acid (R106E), glutamine (R106Q), methionine (R106M) and alanine (R106A) followed by biophysical analyses such as surface plasmon resonance, and fluorescence analysis to identify the interactions between Arg106 and RNA. According to the fluorescence studies, the teriary structures of the mutant N proteins do not vary from those of the wild-type. SPR experiments showed that there are no significant differences in binding capacity and dissociation constant between WT and R106K. In comparison with wild-type, the RNA binding affinity of the R106Q mutant was reduced to 60% of the wild type. R106E and R106M, with negatively charged and hydrophobic side chains, respectively, exhibited a 2-fold decrease in RNA-binding affinity. On the other hands, R106A has lowest RNA-binding affinity. Base on those experiment results, we prove that the positive charge at R106 plays an important role in the interaction between N protein and RNA. This study may benefit the understanding of RNA-binding mechanism of HCoV-OC43 N protein.第一章 前言 1 一、冠狀病毒概述 1 二、冠狀病毒的結構蛋白及其功能 1 三、冠狀病毒的生活史 2 四、冠狀病毒基因組與分類 2 五、HCoV-OC43與疾病 3 七、核殼蛋白N端功能區的NMR結構及結晶結構 5 八、以N端、C端功能區X-ray結構模擬形成螺旋核醣核酸蛋白複合體機制 6 第二章 材料與方法 8 一、實驗流程 8 二、蛋白質表現載體之構築 9 (一) 目標序列的選取 9 (二) 引子之設計與合成 9 (三) 質體DNA之抽取 9 (四) 聚合酶連鎖反應 (PCR, polymerase chain reaction) 10 (五) 質體DNA之限制酶作用 11 (六) DNA之接合反應 11 (七) 轉型作用 (Transformation) 12 (八) Colony PCR 13 (九) Sub-cloning 14 三、蛋白質之大量表現與純化 14 (一) 蛋白質誘發與可溶性測試 14 (二) 蛋白質大量表現 16 (三) His-tag融合蛋白的純化 16 (四) 蛋白質透析 18 (五) 蛋白質濃縮 19 (六) 蛋白質濃度測定 19 四、利用X-ray晶體繞射技術解析蛋白質之結構 20 (一) 預結晶測試 (Pre-Crystallization Test) 20 (二) 蛋白質結晶實驗 21 (三) 結晶條件篩選 23 (四) 抗凍劑 (Cryo-protectant) 條件篩選 23 (五) X-ray晶體繞射實驗 24 (六) Matthews coefficient (VM) 的估計 25 (七) 溶劑比例 (solvent content) 的估計 25 (八) 相位 (phase) 判定 26 (九) 晶體繞射數據之精算 (Refinement) 及分析 26 五、定點突變 (Site-directed mutagenesis) 27 (一) 引子之設計與合成 27 (二) 定點突變 (Site-directed mutagenesis) 27 (三) Sub-clone 29 六、定點突變及wild type之蛋白質純化與透析 29 (一) 定點突變及wild type之His-tag融合蛋白的純化 29 (二) 定點突變及wild type核殼蛋白之透析 32 七、螢光光譜儀 (Fluorescence spectroscopy) 33 八、表面薄膜共振技術（surface plasmon resonance, SPR）分析 34 第三章 結果 38 一、 構築HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區之表現載體 38 (一) HCoV-OC43核殼蛋白order與disorder region及二級結構的預測 38 (二) HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的構築 38 二、HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白大量表現與純化 39 (一) HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的表現與可溶性測試 39 (二) HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的純化 39 (三) HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的濃縮與透析 40 三、HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白之結晶結構 40 (一) HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的結晶條件篩選 40 (二) X-ray繞射數據分析與單位晶格判斷 41 (三) 利用分子取代法 (molecular replacement) 進行結構解析 41 四、定點突變之核殼蛋白的構築、表現與純化 42 (一) 定點突變之核殼蛋白的構築 42 (二) 野生型及突變型之核殼蛋白的表現與純化 42 五、野生型與突變型之核殼蛋白的構形分析 43 六、野生型與突變型之核殼蛋白與RNA結合之活性分析 43 第四章 討論 45 一、HCoV-OC43核殼蛋白order與disorder region及二級結構的預測 45 二、分析與比較HCoV-OC43核殼蛋白N端功能區截切蛋白的結構 45 三、由結構探討RNA與核殼蛋白間的交互作用 47 四、HCoV-OC43核殼蛋白之定點突變 48 五、野生型與突變株之核殼蛋白構形分析 48 六、野生型與突變株之核殼蛋白與RNA結合之活性分析 49 第五章 結論 53 表次 54 圖次 58 附表 87 附圖 88 參考文獻 9