Characterization the Functional RNA Polymerase Subunits of Xanthomonas campestris pv. campestris

原核生物中 RNA polymerase (RNAP) 為負責基因轉錄表現的蛋白複合體，分別由 α、β、β′ 以及 ω 所組成。藉由與 σ 因子重組後辨識位於基因上游的啟動子序列，而得以起始基因的轉錄並達到調控表現的目的。雖然在 E. coli 的研究中對 RNAP 的功能已有諸多的探討，而透過 Thermus aquaticus RNAP 的結構解析對於各次單元間的交互作用也有了進一步的瞭解；但對於 AT-rich 的革蘭氏陽性菌，如 Bacillus subtilis，或是高 G+C 值的 α-proteobacteria 菌屬 Rhodobacter capsulatus，相關研究顯現出這些 RNAP 有著不同於 E. coli RNAP 的轉錄調控機制。而對於 G+C 值高達 65% 的 Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc)，其 RNAP 的轉錄調控機制應當仍有許多值得探討的地方。本論文針對 Xcc RNAP 的研究分為三部分，第一部分為探討不同 Xcc RNAP 純化方式的比較。透過基因重組技術改造 Xcc 野生株 Xc11 從而衍生出 Xc1009 以及 TY109，為分別在 rpoA 以及 rpoC 基因 3′ 端序列上具有 6 × His 的轉譯密碼。在蛋白層析過程中發現，相較於 β′His-tag RNAP，αHis-tag RNAP 對於 Ni-NTA 有較強的結合能力，可獲得較佳的純化結果。體外實驗結果則顯示 αHis-tag 不會影響 core RNAP 與 σ 因子之間的重組。將各次單元基因以 rpoC-rpoB-rpoAHis-tag 的順序選殖到單一質體上，經誘導後可成功於 E. coli 宿主細胞中大量表現重組成為完整的 core RNAP 分子，此方法可簡化純化步驟並縮短過程中所耗費的時間。第二部分乃針對可轉譯出 ω 次單元的 rpoZ 基因進行探討。該基因的表現隨著菌體生長時期而逐漸增加，當 rpoZ 發生突變會造成其下游 spoT 基因的表現受到影響，並且降低了菌體對於環境中營養源的感受性而使生長速度受到影響，推測 rpoZ 參與了菌體中 stringent response 的調節機制。另一方面，ω 次單元與其他 RNAP 次單元共同表現後，所獲得的 core RNAP (α2ββ′ω) 其轉錄活性高於不具 ω 的 core RNAP (α2ββ′) 約 13 倍，顯示 ω 次單元為維持 RNAP 活性的重要因子。第三部分則探討 ECF σ 因子，RpoE (σE)，的表現及調控。RT-PCR 的結果顯示 rpoE 與下游基因 rseA 屬於同一操縱子 (operon)，而 DNase I footprint 的分析結果顯示 rpoE 與 rseA 基因上游皆具有受 σE 所辨識的啟動子序列。於高溫環境 (42℃) 或 5% 乙醇誘導下，σE 的表現量可上升 20% ~ 40%，有助於菌體在逆境中的存活。進一步分析 Xcc 在遭受熱誘導時，σE 對另一熱誘導 σ 因子，σ32，在表現上的影響，結果發現 σ32 的表現量會因 rpoE 的突變而略為下降，推測 σE 在 σ32 因應熱誘導時具有調控的功能。Prokaryotic RNA polymerase (RNAP) is a protein complex responsible for gene expression, consisting of α dimer, β, β', and ω subunits. Initiation of gene transcription is allowed to proceed when a dissociable σ subunit associates with the core RNAP to form the holoenzyme, directing the holoenzyme to bind to the promoter upstream of the target gene. Functions of RNAP in E. coli have been well characterized, and the crystal structure analysis of Thermus aquaticus (Taq) RNAP has provided detail information about interactions among RNAP subunits. However, results of studies in AT-rich gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis, or Rhodobacter capsulatus with high G+C content showed that transcriptional regulation mechanisms of RNAPs of these bacteria are different from that of E. coli RNAP. Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) has a G+C content of 65%, and the transcriptional mechanisms of this bacterium are not well-defined. The aim of this dissertation was to characterize the functions of RNAP subunits in Xcc, and results of this study were divided into three sections. In the first section, purification and characterization of Xcc RNAP with a His-tag fusion at either the C-terminus of α or β' subunit were compared. Result showed that αHis-tag RNAP renders its binding to Ni-NTA stronger than β'His-tag RNAP. Further analyses demonstrated that αHis-tag core RNAP keeps the same ability to interact with σ factors. In addition, coexpression of Xcc RNAP subunits was carried out in E. coli with a plasmid bearing rpoC-rpoB-rpoAHis-tag genes, and in vivo reconstitution of Xcc RNAP subunits to form a core RNAP was successfully achieved. By using this approach, the purification of Xcc RNAP was simplified and the time-cost was reduced. The second section demonstrates the physiological roles of ω in Xcc. Expression of rpoZ was found to be closely related to the cell growth phase. Mutation in rpoZ had influence on expression of the downstream spoT gene. Additionally, the rpoZ mutant exhibited slower growth rate than that of the wild type, suggesting that rpoZ might be involved in regulating the stringent response of Xcc. Moreover, transcriptional activity of the recombinant Xcc core RNAP with ω coexpressed in E. coli had a 13-fold increase than that of the one lacking ω, indicating ω is an important element in maintenance the enzymatic activity of Xcc RNAP. The third section was focused on the expression and regulation of the ECF σ factor, RpoE (σE). RT-PCR analyses demonstrated that rpoE and rseA are in the same operon. The results of DNase I footprint analyses showed the binding by EσE on the σE-dependent upstream promoters of rpoE and rseA. The expression level of σE increases 20 ~ 40% in response to 42℃ or 5% EtOH stresses. Expression of heat-inducible σ32 decreased in rpoE mutant under heat shock, suggesting the role of σE in σ32 expression in response to heat shock.總 目 錄 中文序言 I 英文序言 II 縮寫字對照表 i 第一章 緒論 1 第二章 改造 α 及 β′ 次單元在 RNA 聚合酶表現與純化應用上的比較 2 第三章 ω 次單元的功能探討 3 第四章 rpoE (σE) 操縱組基因的表現與調控 4 附錄 A 緩衝液與培養基成分 A 附錄 B Thermus aquaticus RNA 聚合酶 ω 次單元結構圖 B 附錄 C 論文成果投稿發表 C CH1 一、前言 1-1 二、研究之源起 1-3 三、研究目的 1-4 四、參考文獻 1-5 CH2 中文摘要 2- i 英文摘要 2-ii 一、前言 2-1 二、前人研究 2-2 (一)、原菌純化 2-2 (二)、基因工程改造與應用 2-3 (三)、Polyhistidine-tag (His-tag) 親和性標幟 2-4 三、實驗材料與方法 2-6 (一)、實驗材料 2-6 (二)、實驗方法 2-8 1. Xanthomonas 菌株染色體 DNA 之抽取 2-8 2. 質體 DNA 之抽取 2-8 2.1. 小量質體 DNA 之抽取 2-8 2.2. 大量質體 DNA 的抽取 (CsCl 梯度離心分離) 2-9 3. 聚合酶鏈鎖反應 (PCR) 2-9 4. T-vector 製備 2-10 5. 轉形作用 (Transfomation) 2-10 5.1. 勝任細胞 (Competent cell) 之製備 2-10 5.2. 轉形作用 2-10 6. 電孔法 (Electroporation; Electrotransformation) 2-11 7. DNA 定序分析 2-11 7.1. 雙股 DNA模版之製備 2-11 7.2. DNA 定序分析 (Thermo-cycle sequencing) 2-12 7.3. Auto-sequencing 反應 2-12 8. 南方墨點法 (Southern blot) 2-13 8.1. DNA 探針 (DNA probe) 之製備 2-13 8.2. 雜交反應 (Hybridization) 2-13 9. SDS-PAGE 分析 2-13 10. Xcc σ 蛋白的表現與純化 2-14 10.1. σ70 之純化 2-14 10.2. σ32 之純化 2-14 10.3. σE 之純化 2-14 11. Xcc RNAP 的純化 2-15 11.1. Xcc 野生型 RNAP 的純化 2-15 11.2. Xc1009 及 TY109 RNAP 的純化 2-15 12. 於 E. coli 宿主中受誘導表現之 Xcc core RNAP 的純化 2-16 12.1. pET 系統 2-16 12.2. pBAD 系統 2-16 13. 轉錄活性測試 (in vitro transcription) 2-17 13.1. 非專一性轉錄活性 2-17 13.2. 專一性轉錄活性 2-17 14. 凝膠遲滯分析 (Gel retardation analysis) 2-18 14.1. 引子 5′ 端之放射性標定 (5′ end-labeling) 2-18 14.2. 模版製備 2-18 14.3. 凝膠遲滯分析 2-18 15. DNase I footprinting analysis 2-19 四、結果 2-20 (一)、Xcc 改造株 Xc1009 的構築 2-20 1. 質體構築 2-20 1.1. pSK-rpoA 2-20 1.2. pSK-rpoAKM 2-21 1.3. pT7-L17 2-21 1.4. pT7-AKL17 2-21 2. Xc1009 的 PCR 分析 2-22 3. 南方墨點法分析 2-22 (二)、原菌純化 Xcc RNAP 與其轉錄活性分析 2-23 1. RNAP 蛋白純化 2-23 2. 轉錄活性分析 2-24 (三)、Xc1009 及 TY109 其他性狀的分析 2-24 1. 生長曲線測量 2-24 2. 植物致病能力分析 2-25 (四)、Xc1009 RNAP 對啟動子序列辨識 2-25 1. σ70 啟動子 2-25 1.1. 凝膠遲滯分析 2-25 1.2. DNase I footprinting 分析 2-26 2. σ32 啟動子 2-26 2.1. 凝膠遲滯分析 2-26 2.2. DNase I footprinting 分析 2-26 (五)、蛋白共同表現載體構築 2-27 1. T7 RNAP 表現系統 2-27 1.1. 質體構築 2-27 1.2. 蛋白表現與純化 2-28 2. PBAD表現系統 2-29 2.1. 質體構築 2-29 2.2. 蛋白表現與純化 2-29 (六)、大量表現 Xcc RNAP 的活性分析 2-30 五、討論 2-31 (一)、αHis-tag 與β′His-tag 對 Xcc 的影響 2-31 (二)、純化的XccαHis-tag RNAP 其活性維持較β′His-tag RNAP 穩定 2-32 (三)、多基因組共同表現系統構築策略 2-32 (四)、誘導表現後所純化的 XccαHis-tag RNAP (α2ββ′) 活性不佳 2-35 六、參考文獻 2-36 表 2-41 圖 2-47 CH3 中文摘要 3- i 英文摘要 3-ii 一、前人研究 3-1 (一)、ω 次單元胺基酸組成與構形分析 3-1 (二)、rpoZ 上下游基因組成與功能 3-1 (三)、ω 次單元功能探討 3-3 二、實驗材料與方法 3-5 (一)、實驗材料 3-5 (二)、實驗方法 3-6 1. Xcc RNA 萃取 3-6 2. 引子延伸試驗 (Primer extension) 3-6 3. S1 nuclease protection 3-7 3.1. 放射性探針的製備 3-7 3.2. S1 nuclease digestion 3-7 4. Reverse transcription-PCR (RT-PCR) 3-7 5. 蛋白的表現與純化 3-8 5.1. RpoZ (ω) 蛋白的表現與純化 3-8 5.2. Xc17 及 Xc1116 RNAP 的純化 3-8 6. 西方墨點法 (Western blot) 3-8 6.1. Chromogenic detection system 3-8 6.2. Chemiluminescent detection system 3-9 7. 轉錄活性測試 3-9 8. Xcc 染色體之抽取 (簡易法) 3-9 9. 南方墨點法 (Southern blot) 3-9 10. 胞外多醣分析 3-10 11. β-Gal 活性分析 (β-Galactosidase activity assay) 3-10 三、結果 3-11 (一)、rpoZ 基因及其上下游序列分析 3-11 (二)、rpoZ 基因轉錄起始點分析 3-11 1. 引子延伸試驗 (Primer extension) 3-12 2. S1 nuclease protection 3-12 (三)、rpoZ 突變株 Xc1116 之構築 3-13 1. 質體構築 3-13 1.1. pSK-rpoZm 3-13 1.2. pT-rpoZG 3-14 1.3. pSK-rpoZGm 3-14 2. Xc1116 的 PCR 分析 3-14 3. 南方墨點法分析 3-15 (四)、rpoZHis-tag 改造株 Xc1208 之構築 3-16 1. 質體構築 3-16 2. PCR 及南方墨點法分析 3-16 3. 西方墨點法分析 3-17 (五)、以 RT-PCR 分析 rpoZ 及上下游基因的表現 3-17 (六)、Xcc RNAP 次單元 (α2ββ′ω) 共同大量表現與純化 3-18 1. 表現載體 pBC-CBAZ 的構築 3-18 2. Xcc core RNAP 誘導表現與純化 3-18 3. 西方墨點法分析 3-19 (七)、RpoZ 對 Xcc RNAP 轉錄活性上的影響 3-20 (八)、rpoZ 基因缺失對 Xcc 生長的影響 3-22 (九)、以 lacZ 報導基因分析 rpoZ 對 Xcc 體內轉錄活性的影響 3-23 (十)、胞外多醣分析 3-24 四、討論 3-25 (一)、rpoZ 基因的表現 3-25 (二)、ω 次單元對 Xcc RNAP 活性上的影響 3-26 (三)、ω 次單元在 Xcc 菌體中可能調控某些基因的表現 3-28 (四)、進行大量表現 Xcc RNAP 時所遭遇到的困難 3-29 五、參考文獻 3-31 表 3-36 圖 3-39 CH4 中文摘要 4- i 英文摘要 4-ii 一、前人研究 4-1 (一)、σ 因子的分類 4-1 1. σ70 類 4-1 2. σ54 類 4-2 (二)、ECFσ 因子 4-2 (三)、ECFσ 因子的調控 4-3 (四)、啟動子序列與特性 4-4 (五)、Xcc rpoE 操縱組相關研究 4-5 二、實驗材料與方法 4-7 (一)、實驗材料 4-7 (二)、實驗方法 4-8 1. Xcc RNA 萃取 4-8 2. 引子延伸試驗 (Primer extension) 4-8 3. S1 nuclease protection 4-8 4. 北方墨點法 (Northern blotting) 4-8 5. RpoE (σE) 的表現與純化 4-9 6. 凝膠遲滯分析 (Gel retardation analysis) 4-9 7. DNase I footprinting analysis 4-9 8. 體外轉錄 (in vitro transcription) 4-9 9. Revers transcription-PCR (RT-PCR) 4-9 10. 西方墨點法 (Western blot) 4-9 11. β-Gal 活性分析 (β-Galactosidase activity assay) 4-9 三、結果 4-10 (一)、rpoE 與下游基因其 DNA 調控區域分析 4-10 1. rpoE 4-10 2. rseA 4-11 3. mucD 4-12 (二)、σE-dependent 啟動子 PrpoE 及 PrseA 的轉錄活性分析 4-13 1. PrpoE 4-14 2. PrseA 4-15 3. lacZ 報導基因的活性分析 4-16 (三)、在 SY82 中 rpoE 及 rseA 的表現情形 4-16 (四)、rpoE 基因缺失對 Xcc 生長期間遭受逆境所造成的影響 4-17 (五)、rpoE 及下游基因於熱誘導及乙醇逆境下的表現情形 4-18 (六)、rpoE 對 RpoH (σ32) 表現的影響 4-20 四、討論 4-21 (一)、rpoE 基因與其下游基因的關係 4-21 (二)、rpoE 操縱組的調控機制 4-22 (三)、rpoE 操縱組對於逆境的因應 4-24 五、參考文獻 4-27 表 4-35 圖 4-3