Cloning and characterization of genes controling extracellular protease production from a psychrotrophic bacterium pseudomonas sp.P90

先前，本實驗室分離得到一株能產生胞外蛋白質分解酶及脂質分解酶 的耐冷菌－Pseudomonas sp. P90，並初步檢定其染色體含有gacA基因。此外，也曾以轉座子pUT-Tn5(pfm)/Tc對P90造成突變得到一株同時失去胞外蛋白質分解酶活性及脂質分解酶活性的突變株P90A2，發現突變的發生是因轉座子的Tcr基因插入P90染色體DNA上一個可能轉譯出連續450個胺基酸，稱為ORF 450的位置之故。本實驗研究以聚合酶連鎖反應（PCR）及自體黏接法（self-ligation）從P90的染色體選殖並定序幾乎全長的gacS基因（完成2859 bp的序列）及全長的gacA基因（642 bp），二者的核苷酸序列與轉譯的胺基酸序列與Pseudomonas屬其它菌種的gacS及gacA基因均有從79%至95%的相似性。按照Rodrigue et al.的分類，P90的GacS蛋白質是屬於sensor kinase中的第二型，亦即除了具有input domain與transmitter domain之外也具有receiver domain與Hpt。本實驗研究又以single crossover的方式破壞P90的gacS基因，得到的突變株P90gacS-像P90A2一樣不會表現胞外蛋白質分解酶的活性，RT-PCR的實驗結果顯示這是因為胞外蛋白質分解酶基因的轉錄不能進行所致。此外，P90具有能調控胞外酵素活性表現但其它Pseudomonas屬細菌都沒有的ORF 450核苷 酸序列，相反的，都不具有在其它Pseudomonas屬細菌參與參與GacS/GacA之正向調控作用的rpoS基因（產物為σsfactor），因此P90的胞外蛋白質分解酶等基因的更完整調控機制尚須進一步探討。中文摘要……………………………………… …………………..………..1 英文摘要…………………………………………….……….….…………..2 前言…………………………………….…………………..………………..3 材料方法……………………….…………………………..………………..8 Ⅰ實驗材料……………….…………………………………………………....8 1. 菌種與質體………..……………………………………………..……..8 2. 藥品酵素及放射性同位素 ……………………………………..……..8 3. 培養基配方..……………………………………………………..……..8 4. 試劑與緩衝溶液配方………………………..……………………..…..8 Ⅱ實驗方法…………………………………….……………………………. 13 一、DNA之製備……………………………………………………….…….13 1.小量質體DNA之抽取……………………………………….………..13 2.染色體DNA之抽取………………………………………….………..13 二、質體之構築與選殖 (cloning)…………………………………….……...14 1.限制酶的切割分析…………………………………………………….14 2.DNA回收………………………………………………………………14 3.DNA端點的補齊 ……………………………………………………..15 4.DNA之黏接(ligation) ………………………………….……………...15 5.快速質體篩選法…………………………………………...…………..15 三、聚合酶連鎖反應（PCR）……………………………………………….16 四、洋菜膠體電泳分析……………………………………………………….16 五、細胞的轉形作用 (transformation) ………………..…..….……………...17 1.勝任細胞 (competent cell) 之製備………………….….………….…17 2.轉形作用 (transformation) ……………………….……..…………….17 六、電孔法…………….……………………………………………………...17 七、南方墨點雜配法 (Southern blot )…... ……………………...….………..18 1.探針(probe)之製備…………………….…………………....……..……..18 2.南方墨點法………………………………………………….………….. 18 八、細菌內RNA之純化………………………...………….……...….………19 九、反轉錄聚合脢鏈鎖反應(RT-PCR) ………….………..…….……..……. 20 十、蛋白質之SDS-PAGE電泳分析………………..…………………………20 十一、in situ protease assay (SDS-gelatin-PAGE)…….………………………20 結果……………………………………………….……...………….………. 22 一、Pseudomonas sp. P90 gacS基因的選殖與分析…………………………22 1. 質體pOKS1241之構築………………………………...……………22 2. 質體pOKS1241上選殖片段之定序分析………………...…………22 3. 質體pOKS1388之構築……………………………………..……….23 4. 質體pOKS1388上選殖片段之定序分析…………………..……….23 5. 藉自體黏接法（Self-ligation）選殖包含P90之gacS基因的DNA 片段……………………………………………………………..……..23 6. 保留性區域（conserved domain）之分析……………………………24 二、Pseudomonas sp. P90 gacA基因的選殖……………………………..…..24 1. 質體pGEMT-gacA之構築……………………………………….…..24 2. 質體pGEMT-gacA上選殖片段之定序分析…………………….…..25 3. 保留性區域（conserved domain）之分析……………………………..25 三、突變株之篩選……………………………………………………….……25 1. 以基因間同質重組置換（homologous recombination）將gacS致 變……………………………………………………………………...25 2. 南方墨點法分析...…………………………………………………...26 四、突變株胞外蛋白質分解酶基因的表現………………………………….26 五、反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR）……………………………………26 六、rpoS基因之初步檢測…………………………………………………….27 七、P90中rsmA基因之檢測…………………………………………………28 討論…………………………………………………………………………...29 表……………………………………………………………………………...34 參考文獻………………………………………………………………...……36 圖……….……………………………………………………………………..41 附錄………….……………………………………………………………….