The effects of capsaicin on tNOX expression and cell survival in A375 cells.

Tumor-associated NADH oxidase (tNOX)是與腫瘤細胞生長相關的蛋白，存在於轉型細胞中。研究發現高濃度的辣椒素處理會抑制 tNOX 的活性與蛋白表現量，並抑制細胞的生長和導致細胞凋亡。然而在 HCT116 細胞株中，在辣椒素濃度 10 μM 以下處理，卻會增加 tNOX 蛋白表現量、細胞生長和移動能力，也會誘發上皮間質轉化現象，顯示 tNOX 蛋白表現量與細胞癌化有關。在此篇研究中，我們利用人類黑色素癌細胞株為實驗模式，探討不同濃度的辣椒素對 A375 細胞株的影響。結果發現以濃度高於 50 μM 辣椒素處理，A375 細胞生長受到抑制，而在 400 μM 濃度時，會造成細胞凋亡，也伴隨著 tNOX 蛋白表現量減少；但低濃度 10 μM 處理下，在 72 小時的時候會增進細胞生長。由於在許多腫瘤細胞發生細胞自噬可幫助細胞增加存活或逃避細胞凋亡，所以我們接著檢測 A375 細胞中發生細胞自噬的比例，以辣椒素濃度 100 μM 以上處理細 胞，可發現細胞自噬比例有明顯的提升，而當細胞自噬被抑制時，辣椒素 200 μM細胞凋亡比例增加。進一步我們利用 shRNA 技術抑制 tNOX 蛋白表現，再以辣椒素處理，發現細胞對辣椒素的處理變得較為敏感，在濃度 100 μM 以上細胞凋亡比例就有顯著的提升，這些結果顯示，對於辣椒素處理不敏感的細胞，可藉由抑制細胞自噬或抑制 tNOX 蛋白表現，增加細胞凋亡的發生。Capsaicin is a major component of the hot chili pepper and believed to be a chemopreventive agent. tNOX, a tumor associated NADH oxidase, is a growth-related protein present in transformed cells. Our previous studies have showed that high dose of capsaicin exposure not only inhibits tNOX activity and protein expression but also leads to growth inhibition and apoptosis in cancer cells. However, low concentration of capsaicin treatments (below 10 μM) enhanced tNOX protein expression, cell proliferation, and migration, concurrently with the epithelial-mesenchymal transition. These results demonstrate tNOX protein expression is associated with tumorgenesis. To study the effect of capsaicin on the growth of A375 cells, we exposed A375 cells to capsaicin at different concentrations. Our results showed that exposure of cells to capsaicin at concentration higher than 50 μM inhibits cell growth. Capsaicin induces apoptosis at 400 μM in association with the down-regulation of tNOX protein expression level. At 72 hours, we found that low concentration of capsaicin treatment (10 μM) enhanced A375 cell growth. Due to the fact that autophagy helps cells escape from apoptosis, we speculate whether capsaicin induces autophagy in our system. Our results show that autophagy is significantly induced in response to 100 μM capsaicin and higher. Furthermore, apoptosis is increased when autophagy is inhibited by 3-MA pretreatment. Moreover, tNOX-shRNA knockdown increases capsaicin-mediated apoptosis in A375 cells. Taken together, our results demonstrate that inhibition of tNOX protein expression or autophagy enhances apoptosis induction mediated by capsaicin in cancer cells.目次 中文摘要………………………………………………………………… i 英文摘要……………………………………………………………... ii 目次………………………………………………………………….. iii 第壹章、 前言............................................. 1 一、 惡性腫瘤........................................................ 1 二、 辣椒素 (Capsaicin)................................. 2 三、 Tumor-associated NADH oxidase (tNOX) .............. 4 四、 細胞自噬 (Autophagy) .................................………....... 8 五、 細胞自噬在腫瘤中的重要性…………………….......….. 9 第貳章、 研究動機…………………………………………………… 12 第叁章、 實驗方法…………………………………………………… 13 一、 人類皮膚癌細胞株A375之培養………………………...…… 13 二、 西方墨漬蛋白表現偵測 (Western blotting).……………… 13 三、 細胞DNA轉染技術 (Transfection) …………………………. 14 四、 細胞凋亡測試 (Apoptosis).……………………………………15 五、 細胞自噬測(Autophagy assay)………………………………. 15 六、 過氧化物含量分析 (ROS measurement)..………………….. 16 七、 細胞計數 (Trypan Blue Assay)..……………………….... 16 八、 質體的轉化與純化 (Plasmid transformation and purification)............................................ 16 九、 統計分析 (Statistical analysis)………............... 17 第肆章、 實驗材料…………………………………………………… 18 第伍章、 結果………………………………………………………… 23 一、 不同濃度的辣椒素對A375細胞生長的影響…………………….23 二、 不同濃度辣椒素對A375細胞株細胞毒性……………………… 23 三、 辣椒素對Apoptosis相關蛋白表現量的影響………………… 24 四、 辣椒素對Anti-apoptosis蛋白表現量的影響……………… 24 五、 辣椒素細胞內ROS濃度的影響………………………………… 25 六、 Caspase抑制劑對辣椒素引起細胞凋亡的影響……………… 25 七、 不同濃度辣椒素對tNOX蛋白表現的影響……………………… 25 八、 不同濃度辣椒素處理誘發的細胞自噬反應…………………… 26 九、 抑制細胞自噬對細胞凋亡的影響………………………..... 26 十、 抑制tNOX蛋白表現對於A375細胞株細胞凋亡的影響........ 27 十一、 抑制tNOX蛋白表現對於A375細胞株細胞自噬的影響...... 27 第陸章、 結論……………………………………….……………... 29 第柒章、 討論…………………………………………………….............. 30 第捌章、 參考文獻……………………………….……………..... 33 第玖章、 結果圖表……………………………….……………..... 3