Study on the epitopes of capsid protein of porcine circovirus type 2

豬第二型環狀病毒（porcine circovirus type 2, PCV2）是屬於Circoviridae病毒科中的Circovirus病毒屬，為正二十面體不具封套的環狀單股DNA病毒，是目前發現最小且能感染哺乳類的病毒。其基因體含有11個開讀窗（open reading frame, ORF），其中ORF2可轉譯出一條28 kDa的蛋白質，為最主要之結構蛋白（capsid protein），也是引發宿主產生中和抗體的主要蛋白。此病毒首例是發生於1991年的加拿大，當時證實豬隻罹患PCV2時會造成離乳後多系統消耗性症候群（Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）。其特徵主要為患豬體重漸進性降低、呼吸困難、淋巴結腫大，偶爾會有黃疸和消化失調的情形而造成經濟上的重大損失。所以近幾年來逐漸受到重視，因此尋找有效對抗PCV2感染的方法是非常重要的。本研究之目的乃在研究PCV2結構蛋白之抗原決定位，以找出可刺激產生良好免疫反應之胜肽片段。 由於capsid protein是PCV2之結構蛋白且具有免疫原性，因此本實驗便藉由前人所發表之PCV2結構蛋白之基因序列，經比對分析後設計出12條胜肽片段，並製作胜肽矩陣（peptide array）來尋找結構蛋白之抗原決定位。首先利用設計好的胜肽矩陣與PCV2病毒之抗血清反應，結果發現有兩條胜肽反應較明顯。得此結果後，設計出能表現這兩段胜肽的核苷酸序列，並將此核苷酸序列表現載體轉殖至大腸桿菌表現。在建構表現載體時，分別將該核苷酸序列之一、二及四重複分別建構於表現載體內。接著將純化的表現蛋白分別免疫小白鼠，結果發現三種表現蛋白都可刺激產生良好的抗體反應，其中以pET32a-PCV2-AL 反應最佳。且以此表現蛋白作為抗原進行豬血清抗體之ELISA 之檢測時，我們以各種血清稀釋倍數（20、40、80及100）來進行實驗，結果發現當血清稀釋40倍時，可明顯的來區分陽性或陰性血清，因此以後將以此稀釋倍數來進行現場豬第二型環狀病毒之檢測。Porcine circovirus (PCV), a member of Circoviridae family; in the genus of Circovirus, is a small nonenveloped DNA virus with a circular genome (~ 1.76 kb) and is the smallest virus that can infect the mammalian. PCV has eleven open reading frames and the ORF2 encodes a protein of 28 kDa, which is the major structural capsid protein as well as is capable of inducing host to produce neutralization antibody. PCV2 is associated with the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS), a newly described and identified disease in swine originally reported in Western Canada in 1991. The disease is characterized clinically with fever, dyspnea, anemia, visibly enlarged lymph nodes, jaundice and progressive weight loss, as well as respiratory and digestive disorders. The outbreak of PMWS can cause economical loss. Therefore, it is important to study epitopes of PCV2 capsid protein for the induction of a good immune response. According to the known nucleotide sequences of capsid protein gene, we analyzed and designed 12 peptide fragments of the capsid protein. A peptide array was made to find epitopes of the structural protein. The peptide array was coated on a membrane and reacted with antiserum against the PCV2 virus. Two of these peptides was shown to have a strong positive reaction. The genetic sequences of these two peptides were then linked and constructed together into an expression vector. Furthermore we also constructed vectors that can express two and four repetitions of these two peptides. These recombinant peptides were expressed and purified ,and injected into mice to test for their immune response. The result revealed that these peptides stimulated good immune response, and the pET32a-PCV2-AL induced the best antibody response. Using these peptides as a coating antigen, the pig serum was tested for ELISA. The result showed that when the swine serum at 40-fold dilution obvious differentiation of the positive serum from the negative serum can be obtained.第一章 緒言 1 第二章 文獻探討 3 第一節 豬環狀病毒的歷史背景 3 第二節 豬環狀病毒的分類、組成及特性 4 第三節 豬環狀病毒基因體的結構 5 第四節 豬環狀病毒基因的表現、基因產物及生物功能 5 第五節 豬環狀病毒的病理學、免疫學、流行病學 7 第六節 致病機轉 10 第七節 診斷方法 11 第三章 材料與方法 12 （一）peptide array 12 1.1 設計胜肽片段，製作胜肽矩陣（peptide array） 12 1.2 胜肽矩陣的分析（Peptide Array Analysis） 13 （二）載體的建構 15 2.1 原核表現質體之建構 15 2.2 重組基因在大腸桿菌之表現 15 2.3 DNA片段的純化 16 2.4 接合作用（DNA ligation） 16 2.5 勝任細胞（E. coli competent cells）的製備 17 2.6 轉形作用（transformation） 17 2.7 小量質體DNA的製備（mini-preparation of plasmid） 18 （三）蛋白質膠體電泳分析 18 （四）西方轉漬法（Western blot） 19 （五）重組表現蛋白的純化 20 （六）酵素結合免疫吸附分析法（ELISA） 22 （七）小白鼠免疫血清的製備 22 第四章 結果 23 （一） 設計胜肽片段，製作胜肽矩陣（peptide array） 23 （二） 重組基因在大腸桿菌之表現與確認 23 （三） 表現蛋白的純化與確認 24 （四） 小白鼠血清抗體之偵測 24 （五） 利用酵素結合免疫吸附分析法（ELISA）偵測抗體的力價 25 （六） 將純化的PCV2-AL蛋白當抗原以構築ELISA plate來檢測豬隻血清 26 第五章 討論 5