Explore the Relationship Between Microbial Community and Hydrogen Production in a Granule-Forming Anaerobic Fermentation Reaction

厭氧生物醱酵產氫槽已被證實具有良好的產氫能力，此系統通常操作在常溫、常壓與中性pH條件下，不僅操作容易且不需投入大量的成本；厭氧生物醱酵產氫系統之產氫效能和系統中參與醱酵產氫的微生物族群，有著密切的關係，其中絕對厭氧菌Clostridium sp.被認定為厭氧醱酵菌中最具產氫潛力之菌種；本實驗室早期針對逢甲大學「生物氫能研究團隊」所架設之生物醱酵產氫槽進行菌相分析，結果顯示不同操作條件下，微生物菌相皆存在Clostridium sp.、Streptococcus sp.及Klebsiella sp.，當反應槽操作在低水力停留時間下，系統中僅剩C. pasteurianum及Streptococcus sp.，且反應槽操作在此條件下，具最佳的產氫速率，且同時可觀察到顆粒污泥的生成。本研究則欲釐清不同菌屬存在於產氫反應槽中對產氫效能之影響。 結果指出C. pasteurianum最適生長溫度為37℃及初始pH值為7.0條件下，且在低碳源濃度下可得最大的氫氣產率為1.07 mol H2/mol glucose。K. oxytoca測試結果則顯示，其氫氣產量明顯低於C. pasteurianum，且此菌株在厭/好氧環境下皆能有效利用氧氣，因此可得知Klebsiella sp.存在於生物產氫反應槽中，能有效的消耗系統中的氧氣，使環境達到更厭氧的狀態以利絕對厭氧產氫菌的生長。菌株Strep. lutetieusis則在厭氧環境下具有分泌胞外多醣的能力，此類胞外多醣則具有黏稠等特性，因此推估Strep. lutetieusis所分泌的胞外多醣有助於細胞凝聚。透過Alcian blue染色結果指出，群聚的細胞中有胞外多醣的存在，且胞外多醣大多累積於污泥群聚的中心，因此可得知，胞外多醣生成與顆粒污泥形成的關係的確扮演著重要的角色。此外透過顆粒污泥切片觀察結果，亦可得知顆粒污泥的組成主要是以Clostridium sp.及Streptococcus sp.為主。 綜合以上的結果可得知，生物產氫反應槽中主要的優勢菌種仍是以Clostridium sp.為主，Klebsiella sp.則可以消耗反應槽中的氧氣使環境達到更厭氧狀態，反應槽中常見的非產氫菌Streptococcus sp.，則扮演者凝聚細胞形成顆粒污泥的角色，顆粒污泥的生成則可以減少氫氣反應槽操作在低水力停留時間條件下污泥洗出的現象。The potential of efficient anaerobic fermentation reactor in hydrogen-production system had been well-documented. Benefits of applying these so-called dark fermentation bioreactor includes high hydrogen-producing capacity, high conversion efficiency, less energy intensive, less reactor volume needed and possible wastes reused. Microbial community structure analysis on sludge collected from our previous study showed that C. pasteurianum, Klebsiella sp. and Streptococcus sp. were the major microorganisms in the anaerobic fermentation reactors operated under differential hydraulic retention time. The best hydrogen producing efficiency occurred at low hydraulic retention time when a large amount of granules were self-formed and the predominated bacteria in these conditions were C. pasteurianum and Streptococcus sp. Therefore, the aim of this study is to understand the relationship between these microorganisms and their hydrogen-producing ability in a granule forming anaerobic fermentation reactor. The best hydrogen yield and hydrogen production rate of by a pure culture of C. pasteurianum were observed at 37℃ and at an initial pH of 7.0. K. oxytoca could use oxygen as electron acceptor for growth, its further consumption of oxygen would lead to an anaerobic environment suitable for growth of strict anaerobic C. pasteurianum. Dominate bacterial groups existed in the granule activated sludge was proved to be Clostridium sp. and Streptococcus sp. by the using the Fluorescent in situ Hybridization technique (FISH). Result of Alcian Blue Stain shows that most of EPS existed in the center of aggregated bacterial granular and based on the pure culture experiments, this EPS complex was found to be produced by Strep. lutetieusis . Therefore, there is no doubt that these Streptococcus-produced EPS complexes played an important role in the forming of granule activated sludge. From all of the data collected in this research, it can be concluded that Clostridium sp. is without a doubt the predominated hydrogen producing bacteria in anaerobic fermentation reactor. The existence of Klebsiella sp. would consume oxygen in this system and Streptococcus sp. was found to be in the position of helping bacteria aggregate and forming granule activated sludge, which can avoid being washout when the reactor was operated at low HRT.目錄 中文摘要 I Abstract II 目錄 III 表目錄 VII 圖目錄 VIII 第一章 前言 1 第一節 研究緣起 1 第二節 研究目標 2 第二章 文獻回顧 3 第一節 能源發展 3 一、再生能源 3 二、生質能 3 第二節 氫氣 5 一、氫氣介紹 5 二、常見產氫方法 6 (一)、熱化學法 7 (二)、電化學法 7 (三)、生物法 7 第三節 生物產氫 7 一、產氫微生物 8 二、原理與機制 10 (一)、直接光解 10 (二)、間接光解 11 (三)、光醱酵 12 (四)、暗醱酵 13 第四節 厭氧產氫微生物 16 一、厭氧醱酵產氫微生物 16 (一)、Clostridium 17 (二)、Klebsiella 19 二、厭氧生物產氫之機制 21 (一)、厭氧甲烷代謝途徑 22 (二)、Clostridium屬代謝碳水化合物醱酵途徑 22 (三)、Clostridium屬的產氫酵素 25 第五節 影響厭氧醱酵產氫微生物之環境因素 26 一、溫度 26 二、氧氣 27 三、pH值 27 四、有機酸 28 五、氫氣 29 六、鐵離子 29 七、水力停留時間 30 第六節 厭氧暗醱酵產氫系統 30 一、完全混合式反應槽 31 二、UASB反應器 31 三、CIGSB反應器 31 四、固定化細胞 31 五、自發性顆粒污泥 33 （一）、顆粒污泥形成機制 33 （二）、顆粒污泥對產氫的影響 33 第七節 分子生物技術於環境工程上之應用 34 一、16S rDNA 及functional gene 35 二、聚合酶連鎖反應 36 三、變性梯度明膠電泳 36 四、螢光原位雜合法 38 第八節 分子生物技術於生物產氫之應用 40 一、菌相分析 40 二、定量分析 40 三、產氫酵素之研究 41 第九節 文獻閱讀心得及方向擬定 41 第三章 材料與方法 43 第一節 實驗架構 43 第二節 實驗設備 44 第三節 實驗方法 45 一、菌株分離及純化 45 (一)、污泥來源 45 (二)、培養基組成 45 (三)、菌株分離及純化 46 (四)、菌種鑑定 46 二、C. pasteurianum最佳醱酵產氫環境測試 46 (一)、批次實驗培養基 47 (二)、溫度對C. pasteurianum醱酵產氫之影響測試 47 (三)、碳源濃度對C. pasteurianum醱酵產氫之影響測試 48 (四)、初始pH值對C. pasteurianum醱酵產氫之影響測試 48 三、Gompertz Model 49 四、Strep. lutetieusis及K. oxytoca特性研究 49 五、石蠟包埋及螢光原位雜合 50 第四節 分析方法 51 一、DNA萃取 51 二、PCR 51 三、DGGE 53 (一)、DGGE之分析 53 (二)、Acrylamide/Bis膠體之DNA純化 53 四、革蘭氏染色 54 五、細胞濃度 54 六、pH值分析 54 七、葡萄糖含量分析 54 八、液態組成分析 55 九、氣體含量分析 56 十、胞外多醣分析 56 第四章 結果與討論 57 第一節 菌株分離純化及鑑定結果 57 一、菌株分離及純化 57 二、分生技術鑑定純菌 58 三、利用專一性引子組分析Clostridium sp.純菌之探討 60 （一）、專一性引子組用於反應槽樣本之探討 60 （二）、以純菌株探討專一性引子組之適用性 65 第二節 純菌株C. pasteurianum醱酵產氫測試 67 一、溫度對C. pasteurianum醱酵產氫影響 67 二、初始pH值對C. pasteurianum醱酵產氫影響 69 （一）、產氫醱酵結果 69 （二）、產氫表現分析 73 三、碳源濃度對C. pasteurianum醱酵產氫影響 75 （一）、產氫醱酵結果 75 （二）、產氫表現分析 80 第三節 不同菌株存在產氫反應槽影響產氫效能之探討 83 一、Strep. lutetieusis特性探討 83 二、K. oxytoca特性探討 85 三、反應槽污泥觀察 88 （一）、胞外多醣染色 88 （二）、顆粒污泥觀察 90 第四節 綜合討論 95 第五章 結論與建議 98 第一節 結論 98 第二節 建議 99 參考文獻 100 附錄一 117 表目錄 表2-1、產氫微生物種類 9 表2-2、不同生物產氫程序優缺點比較 15 表2-3、不同醱酵產氫微生物產氫率 16 表2-4、Clostridium菌屬的特徵 18 表2-5、溫度對產氫微生物族群醱酵產氫之影響 27 表2-6、文獻中常使用的寡核苷酸探針 39 表3-1、PYG 培養基配方 45 表3-2、M17 培養基配方 46 表3-3、本研究所使用的引子組及其序列 52 表3-4、本研究所使用引子對PCR條件 52 表3-5、DNA序列長度對應之膠體濃度 53 表3-6、變性梯度膠所使用之各化學物質 54 表4-1、分離菌株比對結果 59 表4-2、不同引子組針對不同基質系統所能偵測到之Clostridium菌屬比較 64 表4-3、不同溫度環境下醱酵產氫表現 69 表4-4、不同初始pH值對醱酵產氫表現 74 表4-5、不同碳源濃度對醱酵產氫表現 81 表4-6、不同Clostridium純菌株產氫醱酵比較 82 圖目錄 圖2-1、全球初級能源供應分佈圖 4 圖2-2、氫氣生產製備流程圖 6 圖2-3、生物產氫方式及其應用之關係圖 8 圖2-4、直接性光解反應之示意圖 11 圖2-5、間接性光解反應示意圖 12 圖2-6、光醱酵反應之示意圖 13 圖2-7、暗醱酵反應之示意圖 14 圖2-8、Klebsiella pneumoniae之醱酵產氫代謝途徑圖 20 圖2-9、厭氧消化代謝示意圖 21 圖2-10、Clostridium acetobutyricum之醱酵產氫代謝途徑圖 24 圖2-11、應用於微生物多樣性研究之分生技術 35 圖2-12、變性梯度明膠電泳原理示意圖 37 圖2-13、變性梯度凝膠電泳呈像圖 38 圖3-1、實驗架構圖 43 圖3-2、批次實驗裝置圖 47 圖4-1、純菌分離之革蘭氏染色顯微觀察結果 57 圖4-2、分離之菌株與反應槽菌相Marker比對DGGE菌相圖 59 圖4-3、反應槽污泥全菌相DGGE圖譜 61 圖4-4、反應槽污泥全菌相DGGE亮帶比對位置概略圖 61 圖4-5、反應槽污泥針對Clostridium sp.菌群結構分析之DGGE圖 62 圖4-6、反應槽污泥針對Clostridium sp.菌相之DGGE亮帶比對位置概略圖 63 圖4-7、Clostridium sp.純菌DGGE圖譜 66 圖4-8、不同溫度環境下醱酵產氫表現圖 68 圖4-9、初始pH值為7.0條件下醱酵產氫結果 71 圖4-10、初始pH值為6.5條件下醱酵產氫結果 71 圖4-11、初始pH值為6.0條件下醱酵產氫結果 72 圖4-12、初始pH值為5.5條件下醱酵產氫結果 72 圖4-13、不同初始pH值對醱酵產氫表現圖 74 圖4-14、碳源濃度為1.0 g COD/L條件下醱酵產氫結果 77 圖4-15、碳源濃度為2.5 g COD/L條件下醱酵產氫結果 77 圖4-16、碳源濃度為5.0 g COD/L條件下醱酵產氫結果 78 圖4-17、碳源濃度為10.0 g COD/L條件下醱酵產氫結果 78 圖4-18、碳源濃度為20.0 g COD/L條件下醱酵產氫結果 79 圖4-19、碳源濃度為30.0 g COD/L條件下醱酵產氫結果 79 圖4-20、不同碳源濃度對醱酵產氫表現圖 81 圖4-21、Strep. lutetieusis好氧環境下生長情形 84 圖4-22、Strep. lutetieusis厭氧環境下生長情形 84 圖4-23、K. oxytoca好氧環境下生長情形 86 圖4-24、K. oxytoca厭氧環境下生長情 86 圖4-25、厭氧環境下C. pasteurianum及 K. oxytoca產氫量比較 87 圖4-26、好氧環境下Strep. lutetieusis及K. oxytoca氧氣消耗比較 87 圖4-27、反應槽污泥胞外多醣染色結果 89 圖4-28、反應槽DGGE菌相圖譜 90 圖4-29、顆粒污泥內部切片100倍顯微觀察結果 91 圖4-30、顆粒污泥內部切片400倍顯微觀察結果(CHIS150) 92 圖4-31、顆粒污泥內部切片400倍顯微觀察結果(LGC) 93 圖4-32、顆粒污泥外部切片400倍顯微觀察結果 9