Self-organization of poly(ethylene glycol)-b-peptide diblock copolymers

Summary Self-assembly of amphiphilic block copolymers is driven by the chemical incompatibility of the constituent blocks and can lead to a variety of morphologies, both in solution and in solid state. The major driving force for the self-assembly of amphiphilic block copolymers are unspecific hydrophobic interactions. As a result, control over nanostructure formation is limited, and the structure and properties of the materials can only be manipulated to a limited extent. For instance, the aggregation number of micelles cannot be exactly predetermined. In addition, micelles and vesicles are typically not uniform in size but possess a certain polydispersity. Synthetic macromolecules generally are heterogeneous with respect to chain length and composition. Biomacromolecules, such as peptides and proteins, however, are characterized by a uniform chain length and a precisely defined monomer sequence (primary structure). These are two important prerequisites that allow the hierarchical self-organization of linear polypeptide chains into proteins with a precisely defined three-dimensional structure and exquisite properties. In addition to hydrophobic interactions, protein folding is also mediated by directed hydrogen-bonding interactions and electrostatic forces. Unlike synthetic macromolecules, the structure and properties of proteins are closely related to chain length and primary structure. As a result, the folding process and protein structure and properties can be precisely controlled at a molecular level. In this Thesis, the conjugation of biological structural motifs and synthetic polymers has been discussed as a versatile strategy to improve control over nanostructure formation of synthetic polymers. As biological segment, a de novo designed coiled coil forming peptide sequence was chosen. Coiled coils have been found in more than 200 native proteins and play an important role in protein stability and are involved in recognition processes. They consist of 2-5 -helices wrapped around each other to form a superhelix and are characterized by a heptad repeat sequence and highly specific intra- and interhelical interactions. Poly(ethylene glycol) (PEG) was selected as the synthetic polymer segment. Apart from its non-toxicity and non-immunogenicity, which is required for biomedical applications, PEG is non-ionic, commercially available in many different molecular weights and known to stabilize peptides and proteins when covalently attached them. Peptides were synthesized using solid-phase peptide synthesis and, subsequently, PEG was attached on-resin. The purified PEG-b-peptide diblock copolymers were characterized by RP-HPLC, 1H-NMR and MALDI-TOF MS techniques. A library of PEG-b-peptide diblock copolymers with different peptide and PEG chain length was synthesized to study the influence of both segment lengths. Circular dichroism and analytical ultracentifugation experiments indicated that the self-organization properties of the peptide segments are retained upon conjugation to PEG. In contrast to conventional amphiphilic block copolymers, which form polydisperse micelles and vesicles, the PEG-b-peptide diblock copolymers, with a peptide chain length of 23 amino acids and a PEG of molecular weight 750 or 2000, self-organize into discrete, well-defined supramolecular aggregates. The self-organization of the diblock copolymers can be described as an equilibrium between unimeric diblock copolymer molecules and dimeric and tetrameric aggregates, which are held together by organization of two or four peptide segments into coiled coil superstructures. In comparison with the pure peptide, conjugation of PEG sterically hampers the formation of tetrameric aggregates and shifts the equilibrium toward smaller dimeric aggregates and unimers. Conjugation of PEG, however, results in an increased stability towards thermal denaturation, presumably via the formation of a PEG shell around the coiled coil superstructures. A detailed investigation of the three-dimensional structure of these PEG-b-peptide diblock copolymers, using pulse Eletron Paramagentic Resonance and Atomic Force Microscopy techniques, indeed showed that the PEG backfolds to the peptide. In addition, EPR indicated that the peptide helices are aligned in parallel fashion. AFM confirmed the formation of small grainary structures with a stiff (peptide) core and a flexible (PEG) shell. The packages have an approximate height of 1 nm and a diameter of 10 nm. The peptides, in contrast, formed large aggregates. Directed mutations in the peptide’s primary structure can be used to accurately control the degree of oligomerization of the PEGylated diblock copolymers and the pH sensitivity of the resulting aggregates. An anionic and cationic PEG-b-peptide diblock copolymer showed a pH-dependent coil-to-helix transition at high and low pH, respectively. An equimolar mixture resulted in the formation of a novel, merely pHinsensitive, de novo designed heteromeric coiled coil. Cytotoxicity studies revealed that the PEG-b-peptide conjugates are relatively non-toxic and non-hemolytic. The cytotoxicity of these compounds is strongly related to their self-assembly behavior. The biocompatibility opens up the pathway for the use of these diblock copolymers in biomedical applications, such as drug delivery systems. In this respect, it has been shown here that the cationic homomeric coiled coils can complex DNA. Gene transfer studies are underway. The ability to transfer the self-organization properties of specific peptide sequences to hybrid block copolymers may allow the development of novel macromolecular materials characterized by unprecedented hierarchical nanoscale order. Accurate control of structure and organization at the nanometer level is advantageous for many advanced applications in e.g. optics, electronics and medicine. In Chapter 6, the structure and supramolecular organization of a de novo designed metalloprotein, which consists of two N-terminal terpyridine modified coiled coil protein folding motif sequences held together by an FeII ion, was described. The organization is not exclusively dictated by metal ion complexation, which is the case in most of the reported metalloproteins so far, but is the result of the interplay of metal ion complexation and protein folding. CD and AUC experiments indicated that the folding properties of the peptide sequences are retained after introduction of the terpyridine ligand and metal complexation. At low concentration, folding and organization of the metalloprotein was reminiscent to that of the native coiled coil and dimeric and tetrameric metalloprotein assemblies were found to exist in equilibrium with unimeric species. Although this could not be unequivocally proven, there are several indications which could suggest that, at least part of, the unimeric metalloproteins consist of an intramolecularly folded coiled coil. At high concentrations, the association behavior of the metal ion complexes dominates the folding properties and leads to large supramolecular metalloprotein assemblies. In Chapter 7, a detailed investigation of the self-assembly of poly(_-benzyl-Lglutamate)- poly(ethylene glycol)-poly(_-benzyl-L-glutamate) (PBLG-PEG-PBLG) rodcoil- rod triblock copolymers in the solid state was described. The tandem molecular interactions present in the triblock copolymers (crystallization, peptide secondary structure, microphase separation) gave rise to a strongly hierarchical level of organization: first, the hydrogen bonds present in the peptide blocks stabilize the peptide secondary structures (-helices and -sheets) and, in addition, chain folding occurs in PEG; second, the -helical and -sheet secondary structures are packed in hexagonal and orthogonal unit cells, respectively; and third, the repulsive interactions between the unlike blocks gave rise to nanostructures typical of phase separated block copolymers. For low peptide fractions, microphase separation results in PBLG and PEG phases rich in all secondary structures, however, large undercooling for the PEG midblock is necessary. Increasing the peptide volume fraction results in interfacial mixing of the two blocks. Here, only the more coherent peptide secondary structure, i.e. the -helices, can survive. Zusammenfassung Die Selbstorganisation amphiphiler Blockcopolymere wird durch die Inkompatibilität der individuellen Blöcke angetrieben und kann sowohl in Lösung als auch in Festphase zu verschiedenen Morphologien führen. Die größte Triebkraft der Selbstorganisation amphiphiler Blockcopolymere sind unspezifische, hydrophobe Wechselwirkungen. Dies führt dazu, dass die Bildung von Nanostrukturen nur begrenzt kontrolliert, sowie die Materialstruktur und Materialeigenschaften nur begrenzt manipuliert werden können. Beispielsweise ist es nicht möglich, die Aggregationszahl von Mizellen genau vorherzusagen. Weiterhin sind Mizellen und Vesikel in ihrer Größe nicht uniform, sondern besitzen eine gewisse Polydispersität. Im Allgemeinen sind synthetische Makromoleküle in Bezug auf Kettenlänge und Zusammensetzung heterogen. Im Gegensatz dazu werden Biomakromoleküle, wie z.B. Peptide und Proteine, durch ihre uniforme Kettenlänge und die genau definierte Sequenz der Monomerbausteine (Primärstruktur) charakterisiert. Diese Kennzeichen sind zwei wichtige Voraussetzungen für die hierarchische Selbstorganisation linearer Polypeptidketten in Proteine mit definierter dreidimensionaler Struktur und ausgezeichneten Eigenschaften. Neben den hydrophoben Wechselwirkungen wird die Proteinfaltung durch gerichtete Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatischen Wechselwirkungen vermittelt. Anders als bei synthetischen Makromolekülen sind Struktur und Eigenschaften der Proteine eng mit der Kettenlänge und der Primärstruktur verbunden. Dadurch ist es möglich, sowohl den Faltungsprozess als auch die Proteinstruktur, und damit die Proteineigenschaften, auf molekularer Ebene genau kontrollieren zu können. In dieser Doktorarbeit wurde die Verknüpfung biologischer Struktureinheiten mit synthetischen Polymeren als vielseitige Strategie zur verbesserten Kontrolle der Bildung von Nanostrukturen in synthetischen Polymeren diskutiert. Als biologisches Segment wurde eine neuartige, “Coiled coil“ bildende Peptid-Sequenz entworfen. “Coiled Coil“ wurden bisher in über 200 nativen Proteinen festgestellt und spielen in der Proteinstabilität und in Erkennungsprozessen ein bedeutende Rolle. Sie bestehen aus zwei bis fünf -Helices, die sich umeinander wickeln und eine Superhelix bilden, die durch eine heptamere Wiederholungssequenz sowie hochspezifische intra- und interhelikale Wechselwirkungen charakterisiert ist. Als synthetisches Polymer Segment wurde Poly(ethylenglykol) (PEG) ausgewählt. PEG ist ein nichtionisches und kommerziell in verschiedenen Molekulargewichten erhältliches Polymer. Darüber hinaus ist PEG nicht toxisch und nicht immunogen, was die wesentlichen Voraussetzungen für eine biomedizinische Anwendung sind. Weiterhin ist bekannt, dass PEG Peptide und Proteine stabilisiert, wenn sie kovalent daran gebunden sind. Die Peptide wurde nach der Methode der Festphasensynthese synthetisiert. Die Kupplung des PEG erfolgte an das am Harz gebundene Peptid. Die gesäuberten PEG-b- Peptid Diblockcopolymere wurden mittels RP-HPLC, 1H-NMR und MALDI-TOF MS Methoden charakterisiert. Um den Einfluss der Kettenlänge nachzuweisen, wurden Diblockcopolymere mit verschiedenen PEG- und Peptid-Kettenlängen synthetisiert. Mit Hilfe von Zirkulardichroismus (CD) und analytischer Ultrazentrifugation (AUZ) konnte gezeigt werden, dass die Eigenschaften der Selbstorganisation des Peptidsegments auch nach der Konjugation mit PEG erhalten bleiben. Im Gegensatz zu konventionellen amphiphilen Blockcopolymeren, die polydisperse Mizellen und Vesikel bilden, organisieren sich PEG-b-Peptid Diblockcopolymere mit einer Peptid Kettenlänge von 23 Aminosäuren und einem PEG-Block mit einem Molekulargewicht von 750 bzw. 2000 in diskrete, genau definierte supramolekulare Aggregate. Die Selbstorganisation der Diblockcopolymeren kann als ein Gleichgewicht zwischen unimeren Diblockcopolymermolekülen und dimeren und tetrameren Aggregaten beschrieben werden, die ihrerseits durch Organisation von zwei oder vier Peptidsegmenten in “Coiled Coil“ Überstrukturen zusammengehalten werden (Abbildung 8.1). Im Vergleich zum reinen Peptid behindert die Anknüpfung des PEG sterisch die Bildung tetramerer Aggregate und verschiebt das Gleichgewicht zugunsten dimerer Aggregate und Unimeren. Andererseits führt die Anknüpfung von PEG, vermutlich durch die Bildung einer PEG-Hülle um die “Coiled Coil“, zu einer Erhöhung der Stabilität gegenüber thermischer Denaturierung. Eine genaue Untersuchung der dreidimensionalen Struktur der PEG-b-Peptid Diblockcopolymere mittels Pulse Elektronen-Paramagnetische-Resonanz (EPR) und Atom-Kraft-Mikroskopie (AFM) ergab in der Tat, dass sich die PEG-Ketten eng um den Peptidkern falten. EPRExperimente zeigten zudem, dass die Peptid-Helices parallel orientiert sind. AFM bestätigte die Bildung von diskrete Nanostrukturen mit einem steifen (Peptid) Kern und einer flexiblen (PEG) Schale. Die Pakete haben eine Höhe von ungefähr 1 nm und einem Durchmesser von etwa 10 nm. Im Vergleich dazu bildeten die Peptide alleine nur große, unspezifische Aggregate. Gezielte Mutationen in der Peptid-Primärstruktur konnten dazu genutzt werden, den Oligomerisationsgrad der PEGylierten Diblockcopolymere und die pH-Sensitivität der resultierenden Aggregate genau zu kontrollieren. Anionische und kationische PEG-b- Peptid Diblcokcopolymere zeigten einen pH-abhängigen Knäuel-Helix-Übergang bei hohem bzw. niedrigem pH-Wert. Die äquimolare Mischung aus einem anionischen und einem kationischen Diblockcopolymer führte zu einer neuartigen, aber pHunabhängigen heteromeren “Coiled Coil“. Zytotoxizitätstudien ergaben, dass die PEGb- Peptid Konjugate relativ untoxisch und nicht-hemolytisch sind. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Zytotoxizität dieser Verbindungen eng mit dem Selbstorganisationsverhalten verbunden ist. Die gute Biokompatibilität eröffnet den Weg für die Anwendung dieser Diblockcopolymere in biomedizinischen Applikationen, wie z.B. drug delivery Systeme. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass die kationischen homomeren “Coiled Coil“ in der Lage sind DNA zu komplexieren. Gentransferexperimente sind in Arbeit. Die Fähigkeit, die Eigenschaften der Selbstorganisation von spezifischen Peptidsequenzen auf Hybrid-Blockcopolymere zu übertragen, ermöglicht die Entwicklung neuartiger polymerer Materialen, die durch eine bisher nicht erreichte Ordnung auf nanoskopischer Ebene gekennzeichnet sind. Die genaue Kontrolle von molekularer Struktur und Organisation bietet Vorteile bei der Entwicklung neuer Anwendungen im Bereich Optik, Elektronik oder Medizin. In Kapitel 6 wurde die Struktur und Selbstorganisation eines neuartig entwickelten Metalloproteins beschrieben, welches aus zwei N-terminal Terpyridin-modifizierten “Coiled coil“ besteht, die durch ein FeII-Ion zusammengehalten werden. Die Struktur wird nicht, wie im Fall der bisher beschriebenen Metalloproteinen, ausschließlich durch die Metallionkomplexierung bestimmt, sondern ist das Resultat des Wechselspiels zwischen Metallionkomplexierung und Proteinfaltung. Wie CD- und AUZ-Experimente zeigten, bleiben die Faltungseigenschaften der Peptidsequenzen auch nach der Einführung der Terpyridinliganden und Metallkomplexierung erhalten. Bei niedrigen Konzentrationen waren Faltung und Organisation der Metalloproteine vergleichbar mit dem Verhalten der ursprünglichen “Coiled coil“ und es wurden sowohl dimere als auch tetramere Metalloprotein-Aggregate im Gleichgewicht mit ihren unimeren Spezies gefunden (Abbildung 8.2). Obwohl dies nicht eindeutig nachgewiesen werden konnte, gibt es einige Hinweise, die darauf hindeuten, dass zumindest ein Teil der unimeren Metalloproteine aus intramolekular gefalteten “Coiled coil“ bestehen. Bei hohen Konzentrationen dominiert jedoch das Assoziationsverhalten des Metallion-Komplexes die Faltungseigenschaften und führt zu großen, supramolekularen Metalloprotein-Aggregaten. In Kapitel 7 wurde eine detaillierte Untersuchung der Selbstorganisation von Poly(- Benzyl-L-Glutamate)-Poly(Ethylen Glykol)-Poly(-Benzyl-L-Glutamate) (PBLG-PEGPBLG) Stäbchen-Knäuel-Stäbchen Triblockcopolymeren in fester Phase beschrieben. Die aneinander gekoppelten molekularen Wechselwirkungen, die in einem Triblockcopolymer vorhanden sind (Kristallisation, Sekundärstruktur der Peptide und Mikrophasenseparation), haben einen festen hierarchischen Ablauf der Organisation zur Folge: 1.) die im Peptidblock enthaltenen Wasserstoffbrückenbindungen stabilisieren die Sekundärstruktur des Peptides (-Helix, -Faltblatt) und darüber hinaus tritt eine Faltung der PEG-Kette auf; 2.) die -helikale und -Faltblatt Peptid-Sekundärstrukturen packen sich in hexagonalen respektive orthogonalen Einheitszellen; 3.) die abstoßenden Wechselwirkungen zwischen den unterschiedlichen Blöcken führen zu für phasenseparierte Blockcopolymere typischen Nanostrukturen. Bei kleineren Peptidanteilen hat die Mikrophasenseparation zur Folge, dass die PBLG- und PEGPhasen alle Sekundärstrukturen enthalten. Allerdings ist hierfür eine starke Abkühlung, die nur Einfluss auf den mittleren PEG-Block hat, notwendig. Eine Erhöhung des Peptid-Volumenanteils führt zu einer Vermischung der Blöcke an der Grenzschicht. In diesem Fall existiert nur die kohärentere Peptid-Sekundärstruktur - die -Helix – weiter