Promoter architecture and transcriptional activation of Rap1-independent ribosomal protein genes in Saccharomyces cerevisiae

La costruzione di nuovi ribosomi costituisce per ogni cellula un importante investimento energetico, necessario per assicurare l’elevata capacità di sintesi proteica richiesta quando le condizioni di crescita sono in grado di sostenere un’intensa attività metabolica. Dato il notevole dispendio di energia che comporta, la biogenesi del ribosoma deve essere invece tempestivamente repressa in caso di stress o di carenza di nutrienti, in modo da permettere la sopravvivenza delle cellule grazie all’indirizzamento delle scarse risorse disponibili verso le esigenze metaboliche imposte dal cambiamento delle condizioni di crescita. In Saccharomyces cerevisiae, diversamente dalla maggior parte degli altri eucarioti, i meccanismi che consentono la modulazione della biogenesi dei ribosomi agiscono prevalentemente attraverso il controllo trascrizionale coordinato degli oltre 750 geni i cui prodotti sono coinvolti, con funzioni strutturali e non, in questo processo biosintetico. Le strategie regolative richiedono l’intervento di numerosi fattori specifici per ogni classe di geni e permettono il controllo concertato dell’attività di tutte e tre le RNA Polimerasi nucleari. Differenti vie di segnalazione cellulare esercitano un preciso controllo sui diversi regolatori trascrizionali in modo che ogni singolo gene risulti finemente regolato in base alle esigenze della cellula e in maniera coordinata rispetto a tutti gli altri che partecipano alla biogenesi del ribosoma. Numerosi studi hanno finora contribuito alla comprensione degli aspetti regolativi che assicurano il controllo della maggior parte dei 138 geni codificanti per le 79 proteine ribosomiali, i cui promotori presentano siti di legame per il General Regulatory Factor Rap1. Il presente lavoro di tesi si propone invece di contribuire alla individuazione e caratterizzazione degli elementi cis- e trans-regolativi della classe decisamente meno numerosa di geni Rap1-indipendenti, il cui promotore contiene la sequenza riconosciuta da un altro GRF, la proteina Abf1. Grazie ad un iniziale approccio in silico basato sull’analisi filogenetica delle regioni a monte di questi geni, è stato possibile identificare gli elementi che accomunano l’architettura dei promotori di RPL3, RPL4B, RPP1A, RPS22B, RPS28A e RPS28B: il sito di legame per Abf1, un tratto poli(dT) e una sequenza corrispondente al sito di legame per Fhl1, regolatore chiave dei geni RP, situata tra i due elementi precedentemente citati. Attraverso successivi esperimenti in vivo ed in vitro sono state ottenute conferme dell’associazione dei regolatori Abf1 e Fhl1 ad alcuni di questi promotori. Un primo passo verso l’approfondimento dei meccanismi di regolazione trascrizionale dei geni considerati è stato compiuto grazie alla costruzione e all’analisi di espressione di mutanti genomici del promotore: i risultati ottenuti evidenziano il ruolo svolto da Abf1 nell’attivazione trascrizionale di questi geni in condizioni di crescita ottimali e suggeriscono anche un suo possibile contributo al reclutamento di Fhl1. Le analisi condotte hanno inoltre sottolineato la particolarità del gene RPS22B, che ospita in uno dei suoi due introni la sequenza codificante per lo snoRNA snR44. A monte di questo gene è stato identificato un sito di legame per il regolatore Tbf1, la cui presenza potrebbe rappresentare il residuo evolutivo di un precedente assetto regolativo dei geni per proteine ribosomiali, o potrebbe essere richiesta per la regolazione del gene SNR44.Ribosome biogenesis is the most energy-consuming process that takes place in the cell. According to this energetic expensiveness, it must be tightly regulated in response to cellular metabolic needs. A high rate of ribosome production is required when environmental and nutritional conditions can support a strong protein synthesis and a rapid cell growth. By contrast, the synthesis of new ribosomes must be promptly abolished in response to different intracellular and environmental stresses to redirect the energetic resources towards the metabolic requirements that ensure the cellular survival. In Saccharomyces cerevisiae, ribosome biogenesis is mainly regulated at the transcriptional level and it requires the coordinated expression of more than 750 genes coding for both proteins and RNA molecules that participate to the assembly of functional ribosomes. Several specific transcription factors are required to ensure a tuned regulation of RNA Polymerases I, II and III transcriptional activity, and different intracellular signaling pathways control these transcriptional regulators to orchestrate the coordinate expression of each member of this complex genetic program in response to different stimuli. Several studies have extensively contributed to the understanding of the regulatory mechanisms that allow transcriptional control of Rap1-dependent ribosomal protein genes, but little is known about the small class of RP genes whose promoters include an Abf1 binding site, instead of Rap1 binding sites. The present work attempts to unravel cis- and trans-regulatory elements that take part to the transcriptional regulation of this subset of ribosomal protein genes. Exploiting an initial in silico approach based on the phylogenetic footprinting analysis of their upstream regulatory sequences, we found out that RPL3, RPL4B, RPP1A, RPS22B, RPS28A and RPS28B share a common promoter architecture. In addition to an Abf1 binding site, these promoters show a poly(dT) tract and a strongly conserved sequence that corresponds to the predicted binding site for Fhl1, an essential and specialized regulator of RP genes transcription. Subsequent in vivo and in vitro analyses allowed us to confirm the actual association of Abf1 and Fhl1 proteins to their corresponding binding sites in some of these promoters. Furthermore, a systematic study of gene expression profile performed on different genomic promoter mutants provided the first step towards a deeper comprehension of the transcriptional regulatory mechanisms underlying these genes expression control. Our results demonstrated that the presence of an intact Abf1 binding site is essential to fully activate gene transcription under optimal growth conditions, suggesting a possible involvement of Abf1 in Fhl1 recruitment to these promoters. Remarkably, this study also highlights some distinctive traits of RPS22B gene structure and regulation. The presence of a Tbf1 binding site within its promoter could either represent the evolutionary remnant of an ancient Tbf1-based RP genes transcriptional regulatory mechanism, or it could be related to the presence of the snoRNA coding gene SNR44 in the intronic sequence of RPS22B