Caratterizzazione biochimica di serina racemasi umana: substrati, inibitori ed effettori allosterici

In recent years, many neurodegenerative diseases have been correlated to the dysfunction of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs)-mediated neurotransmission. Drugs that directly affect the activity of the receptors evoke strong responses and typically show severe side effects. In this framework, serine racemase (SR) – the enzyme responsible for D-serine production in the brain – was suggested as an alternative therapeutic target. The detailed characterization of human SR (hSR) is currently rather limited, with a few published biochemical studies that provides a limited insight into the understanding of its regulation mechanisms. This work was aimed at achieving a more complete characterization of hSR dynamics, function and regulatory properties. After improving the protein purification yield and stability, which had so far limited the biochemical characterization of hSR, the dependence of L- and D-serine β-elimination and L-serine racemization activities on ATP concentration was characterized and found to be strongly cooperative. ATP binding to the holo-enzyme, monitored by the fluorescence changes of the coenzyme, was also determined to be cooperative. The well-known active site ligands glycine and malonate increase the hSR affinity for ATP and, conversely, ATP increases the non-cooperative glycine and malonate binding. These results indicated a cross-talk between allosteric and active sites, leading to the stabilization of two alternative protein conformations endowed with significantly different microscopic dissociation constants for ATP , as estimated by applying the Monod, Wyman and Changeux model. To further investigate this allosteric communication, we probed the active site accessibility by quenching of the coenzyme fluorescence in the absence and presence of ATP. We found that ATP stabilized a closed conformation of the external aldimine Schiff base, suggesting a possible mechanism for ATP-induced hSR activation. We also investigated the effect of halides on hSR activity and we found that it is affected in the order fluoride>chloride>bromide. On the contrary, iodide elicited a complete inhibition, accompanied by a modulation of the tautomeric equilibrium of the internal aldimine. Finally, we applied two different approaches for the search of new hSR competitive inhibitors. With the first approach, we developed a new series of compounds based on cyclopropane scaffold and on malonate core modifications. With the second approach, a library of compound was screened against hSR structure. The positive molecules were tested with in vitro analysis. Our results can provide useful indications for the development of novel SR inhibitors.Negli ultimi anni è stato accertato che molte malattie neurodegenerative risultano correlate a disfunzioni della trasmissione neuro-eccitatoria mediata dai recettori per il N-metil-D-aspartato (NMDAR). I farmaci che regolano direttamente l’attività di tali recettori causano l’insorgenza di gravi effetti collaterali. A questo proposito la serina racemasi (SR) – l’enzima responsabile della sintesi della D-serina a livello cerebrale – può rappresentare un alternativo bersaglio terapeutico. Attualmente la caratterizzazione dettagliata della SR umana (hSR) è ancora limitata, con la pubblicazione di pochi studi biochimici che restituiscono una visione completa per la comprensione dei suoi meccanismi di regolazione. Questo lavoro è stato volto all’ottenimento di una più completa caratterizzazione delle dinamiche, della funzione e delle proprietà regolative di hSR. Dopo aver migliorato le rese di purificazione e la stabilità della proteina, che finora avevano limitato la caraterizzazione biochimica di hSR, è stata caratterizzata la dipendenza dall’ATP dell’attività di β-eliminazione della L- e D-serina e di racemizzazione della L-serina ed è risultata essere fortemente cooperativa. Il legame dell’ATP all’oloenzima, monitorato per mezzo delle variazioni di fluorescenza del coenzima, è risultato a sua volta cooperativo. I ligandi noti del sito attivo glicina e malonato aumentano l’affinità di hSR per l’ATP e, d’altra parte, l’ATP aumenta l’affinità di legame non cooperativo di glicina e malonato. Questi risultati indicano una comunicazione reciproca tra il sito attivo e il sito allosterico, portando alla stabilizzazione di due conformazioni alternative che presentano costanti di dissociazione microscopiche significativamente differenti, come stimato tramite l’analisi con il modello di Monod, Wyman and Changeux. Per comprendere ulteriormente questa comunicazione allosterica, abbiamo verificato l’accessibilità del sito attivo attraverso il quenching della fluorescenza del coenzima, in presenza e in assenza di ATP. È stato verificato che l’ATP stabilizza una conformazione chiusa della sito attivo in aldimina esterna, suggerendo un possibile meccanismo per l’attivazione dell’hSR indotta dall’ATP. Abbiamo inoltre studiato l’effetto degli alogenuri sull’attività di hSR, con un influenza nell’ordine fluoruro>cloruro>bromuro. Al contrario, lo ioduro promuove una completa inibizione, accompagnata da una modulazione dell’equilibrio tautomerico dell’aldimina interna. In conclusione, abbiamo applicato due diversi approcci per la ricerca di nuovi inibitori competitive dell’hSR. Nel primo caso abbiamo sviluppato una serie di composti basati sullo scaffold del ciclopropano e sulla modificazione del nucleo del malonato. Il secondo approccio ha previsto lo screening di una libreria di composti contro la struttura dell’enzima. Le molecole positive sono state poi testate in vitro. Questi risultati possono fornire utili indicazioni per lo sviluppo di inibitori innovativi per hSR