FUNCTIONAL ANALYSIS OF POPLAR (Populus nigra L. and P. nigra x P. deltoids) DURING ENVIRONMENTAL EXPOSURE TO METALS

Dispersal of trace elements, metals and organics is relevant for environmental contamination and for fresh water utilization. Plant species have been used to decrease or remove the contaminants in polluted sites and in particular, tolerant and hyperaccumulator species seem promising for removal of metals in contaminated soils. The practical application of natural hyperaccumulators in phytoremediation is difficult because of their small biomass at maturity and reduced growth rates. For these reasons the metal uptake capacity of plants with higher biomass, such as trees belonging to Salicaceae family like poplar and willow, has been investigated. Laboratory and field trials have found that different clones of the genus Populus have different tolerance and metal uptake in contaminated environments. In this work we studied the behavior of three Italian selected poplar clones: P.nigra (clones 58-861 and Poli) and a hybrid P.nigra x deltoides (A4A), which showed different Cd tolerance and capacity and Cd uptake, accumulation and traslocation. The modifications occurring in the proteome of the three clones subjected to Cd treatments were investigated by comparing also the physiological behaviour of the clones. Rooted cuttings of three poplar clones were grown in hydroponic cultures with 0 μM CdSO4 (control), 20 μM CdSO4 for 48 hours (short term treatment) and 20 μM CdSO4 for 14 days (long term treatment). (i) Different physiological parameters were analyzed: total leaf area, stem growth and elongation of the roots. Metal uptake and root to shoot translocation were observed by mineral analysis by Atomic Absorption Spectroscopy (ASS). Metal compartmentalization in leaves, roots and stems were analyzed by Scanning Electron Microscopy with microanalysis (SEM/EDX). (ii) Proteomic analysis was performed on crude protein extracts, obtained from leaves. Proteins with different isoelectric point (pI) and hydrophobicity were separated by a 2D liquid chromatography technique (ProteomeLab PF2D, Beckman). Qualitative and quantitative differences between protein profiles of treated and untreated samples were evidenced by DeltaVue Software (Eprogen). Proteins differently abundant in various conditions were characterized by MALDI-TOF/MS to infer their possible role in metal response. The results will be discussed with the aim to understand the different processes at the basis of accumulation and tolerance of metal by plant species.Il lavoro di ricerca ha avuto come oggetto una serie di analisi mirate a migliorare la comprensione dei meccanismi di tolleranza e accumulo di metalli pesanti in diversi cloni di pioppo. Tre cloni del genere Populus sono stati studiati in relazione alla loro risposta alla contaminazione da metallo pesante quale il cadmio, al fine di comprendere e quantificare le differenze che esistono tra di loro in termini di resistenza, capacità di accumulo e traslocazione del metallo, e al fine di comprendere le basi molecolari delle diverse risposte. Talee di Pioppo (Populus sp.) ottenute da due linee pure (cloni Poli e 58861) e da una linea ibrida (A4A), sono state fatte crescere in coltura idroponica e trattate con 20µM CdSO4 per 48 ore (short term) o per 14 giorni (long term). L’effetto fisiologico del trattamento con il metallo è stato valutato statisticamente misurando una serie di parametri morfologici e fisiologici (numero foglie, larghezza, lunghezza e area fogliare, lunghezza totale degli steli e lunghezza della radice principale, percentuale delle zone interessate da clorosi, necrosi e lesioni fogliari). L’ analisi del contenuto di Cd, mediante assorbimento atomico, nei diversi tessuti degli organismi in analisi ha permesso di valutare le differenze tra il cloni in termini di capacità di accumulo e traslocazione del metallo. Inoltre, per identificare biomarcatori di accumulo e traslocazione sono state effettuate analisi di proteomica comparativa mediante un sistema “gel free” di cromatografia liquida bidimensionale ProteomeLab Pf2D. L’identificazione di alcune di queste proteine mediante spettrometria di massa MALDI-TOF ha potuto definire quali classi funzionali sono coinvolte nei meccanismi di risposta agli stress da metalli e quali possano essere le basi molecolari che spiegano l’estrema variabilità intraspecifica in risposta alla contaminazione da cadmio. Infine la mappatura e la distribuzione del cadmio (Cd) e di altri elementi, come il calcio (Ca) e il potassio (K), nei diversi tessuti delle piante è stata possibile grazie alla microanalisi con SEM/EDX