Establishment of methods of gene silencing in grape (Vitis vinifera L.) for functional genomic studies.

Sviluppo di approcci di gene silencing in vite (Vitis vinifera L.) per studi di genomica funzionale. Nel corso del lavoro è stato messo a punto un sistema per la micropropagazione della vite in modo tale da disporre delle piantine durante tutto il corso dell’anno evitando pause di lavoro dovute al fisiologico riposo vegetativo annuale della vite. Utilizzando le banche dati del NSBI, TIGR e IASMA Genomics sono state trovate le sequenze in vite dei geni che regolano la risposta di difesa contro i patogeni e della Phytoene desaturase (PDS). E’ stato prodotto un vettore per il gene silencing che da origine a dsRNA contenente la sequenza del gene che codifica per la Phytoene desaturase, con in quale sono stati condotti gli esperimenti di agroinfiltrazione. Sono stati preparati vettori per il silencing contenenti nella cassetta di espressione i principali geni coinvolti nella regolazione delle risposte di difesa ai patogeni (dei quali si vuole studiare la funzione), sia per la trasformazione con Agrobacterium tumefaciens, sia per la trasformazione con metodo biolistico. La trasformazione transiente della vite con Agrobacterium è stata messa a punto sulle cv Aleatico e Superior e i risultati sono stati validati con le osservazioni al microscopio e le RT-PCR semiquantitative. E’ stata ottenuta la trasformazione con il metodo del particle bombardment del mesofillo fogliare delle cv Pinot nero e vite Run1 utilizzando il costrutto pUCGUS come marcatore che contiene il gene GUS (β-glucuronidase), dopo aver provato diversi parametri pre e post bombardamento. Le metodiche impiegate sono state di tipo genomico e molecolare.Establishment of methods of gene silencing in grape (Vitis vinifera L.) for functional genomic studies. In this work, a system for grape micropropagation has been elucidated to ensure availability of the grape plant during the year to minimize work stoppages due to the annual physiological rest of the grape. Using the NSBI, TIGR and IASMA Genomics databanks, sequences of genes regulating defence responses against pathogens and the sequence of the gene which encodes Phytoene desaturase (PDS) have been found. A vector for gene silencing which creates dsRNA containing the sequence of the gene which encodes PDS has been produced and used in agroinfiltration experiments. Vectors for silencing which contain the main genes involved in the regulation of the defence responses against pathogens have been prepared and their functions will be studied. These vectors have been used in Agrobacterium tumefaciens transformation and particle bombardment transformation. Transient transformation of the grape by Agrobacterium has been used on cv Aleatico and cv Superior and the results have been verified by microscopic observations and semiquantitative RT-PCR. After setting pre and post-bombardment parameters, the particle bombardment transformation of leaf mesophyll of cv black Pinot and cv Run1 grape using the marker pUCGUS construct which contains the GUS gene (ß-glucuronidase) has been obtained. Genomic and molecular methods have been used