Caratterizzazione dei meccanismi neuroprotettivi della guanosina e dei ligandi dei recettori sigma

2007/2008Rispetto al ruolo svolto da nucleosidi e nucleotidi adeninici come neurotrasmettitori/neuromodulatori, quello delle purine a base guaninica è ancora largamente sconosciuto. In questo studio, è stato valutato l’effetto della guanosina sulle cellule SH-SY5Y, derivate da un neuroblastoma umano. In questa linea cellulare, la guanosina aumenta la proliferazione di cellule sottoposte a stress da deprivazione da siero per 24, 48 e 72h (MTT test), effetto che sembra coinvolgere la via delle MAPK e quella di PI3K, ma non quella dell’AMP ciclico (AMPc). Utilizzando [3H]Adenosina e [3H]Guanosina è stato dimostrato che entrambe le purine subiscono uptake con una cinetica sovrapponibile ma con affinità 100 volte minore per la guanosina rispetto all’adenosina. L’uptake è dovuto principalmente a trasportatori equilibrativi NBTI-sensibili, mentre risultano assenti i trasportatori concentrativi. Mediante esperimenti di binding su membrane di cellule SH-SY5Y è stata confermata la presenza di siti per [3H]NBTI saturabili e reversibili; esperimenti di competizione hanno confermato la capacità di guanosina e adenosina di spiazzare [3H]NBTI dai suoi siti di legame con IC50 pari a 1568 ± 243 µM e 191 ± 59 µM, rispettivamente. Su cellule mantenute al 10% di siero, la guanosina provoca variazioni morfologiche quali allungamento dei neuriti tempo- e concentrazione-dipendente, indice di differenziazione. L’effetto è visibile già dopo 24 h di trattamento e dopo 72 h è risultato paragonabile a quello dell’acido retinoico. L’effetto differenziante della guanosina è risultato indipendente dal blocco dei trasportatori NBTI-sensibili e dall’attivazione dei recettori A1 e A2A dell’adenosina. Studi di tempo-dipendenza fino a 7 giorni di trattamento sono stati effettuati mediante colorazione del citoscheletro con Falloidina. Studi di immunocitochimica hanno evidenziato la capacità della guanosina di aumentare in maniera tempo-dipendente l’espressione dei markers neuronali beta-tubulina, MAP2 e NeuN. Tramite test della sulforodamina B è stata verificata la capacità della guanosina di ridurre in maniera tempo- e concentrazione-dipendente la proliferazione cellulare, come conseguenza dell’effetto differenziante. Dopo 7 giorni di trattamento, acido retinoico, guanosina e il suo derivato guanina hanno determinato una riduzione della proliferazione con valori di IC50 pari a 37 ± 4 µM, 172 ± 113 µM e 190 ± 17 µM, rispettivamente. Non essendoci in letteratura dati riguardanti la presenza dell’enzima PNP su cellule di neuroblastoma, ne è stata accertata l’espressione nella linea cellulare SH-SY5Y tramite RT-PCR. Per quanto riguarda le vie di trasduzione del segnale attivate nell’effetto neuritogenico indotto da guanosina, prove dirette e indirette dimostrano il coinvolgimento della via di MAPK e PI3K, ma non del AMPc. Inoltre, la guanosina non determina variazioni dei livelli di [Ca+2]i. In cellule differenziate per 48h con guanosina o acido retinoico si è osservato un aumento significativo dei livelli basali di AMPc, rispetto alle cellule non differenziate, e un potenziamento dell’attività dell’inibitore delle fosfodiesterasi di tipo IV rolipram da parte della guanosina 100 µM. In conclusione, questi risultati dimostrano che la guanosina gioca un ruolo importante nell’omeostasi neuronale, agendo come un composto endogeno neuroprotettivo e differenziante. In collaborazione con il Dipartimento di Chimica Farmaceutica dell’Ateneo e dell’Università degli Studi di Pavia è stato fatto uno screening mediante la tecnica del Radioligand Binding di circa 100 composti di neosintesi con possibile affinità verso i recettori sigma-1 e sigma-2, classe di recettori coinvolta nella neuroprotezione. Per valutare l’efficacia dei ligandi dei recettori sigma-1, in termini di agonismo o antagonismo, sono stati effettuati due test in vitro. Il primo sfrutta la capacità della fenitoina di spostare verso sinistra la curva di competizione di agonisti mentre non ha alcun effetto sugli antagonisti. I risultati ottenuti non sono stati incoraggianti a causa della scarsa sensibilità del metodo. Il secondo test sfrutta la capacità di agonisti dei recettori sigma-1 di differenziare le cellule SH-SY5Y nelle quali abbiamo verificato la presenza di entrambi i sottotipi recettoriali ottenendo valori di Kd pari a 19,8 ± 5 nM e 17,9 ± 3 nM per [3H]PTZ e [3H]DTG, rispettivamente. L’agonista pentazocina è risultato l’unico composto di riferimento in grado di indurre differenziazione mentre gli antagonisti aloperidolo e DTG sono risultati inefficaci. Con il test della Sulforodamina B, sempre sfruttando la diminuzione della proliferazione come conseguenza di un’attività differenziante, abbiamo confermato che solo la pentazocina è in grado di ridurre in maniera tempo- e concentrazione- dipendente la proliferazione cellulare con un valore di IC50 a 72 h pari a 44 ± 4 µM. Estendendo lo studio ad alcuni dei ligandi di neosintesi, quello maggiormente affine e selettivo, LEk (IC50s1 0,104 ± 0,034 nM; IC50s2 492 ± 102 nM), è risultato in grado di mimare l’effetto della pentazocina sulla proliferazione e differenziazione cellulare. Questo suggerisce un suo possibile e prezioso impiego come agonista altamente selettivo e ad alta affinità per lo studio dei recettori sigma-1 e dei potenziali impieghi terapeutici ad essi correlati.XXI Ciclo197