Ottimizzazione di sistemi per la selezione di librerie peptidiche a sequenza casuale

This doctoral work is part of the Never Born Protein project. It is based on idea that the proteins existing in our Earth are only an infinitesimal fraction of the all possible sequences. To use an analogy to explain the relationship between existing and possible proteins, we can say that the ratio between them corresponds roughly to the ratio between the Sahara desert and a single grain of sand. Given the vast number of possible sequences, Nature could not have explored all possible amino acid combinations. Therefore, we are faced with the problem of how the “few” extant proteins were produced and/or selected: do extant proteins possess any special chemico-physical properties (such as solubility, fold, functionality, thermodynamic stability) that made their selection inevitable? Or rather are they the result of contingency, a frozen accident? If they are the result of contingency, there exists a universe of proteins which properties have never been sampled by nature: the Never Born Proteins – NBP. To investigate the NBP world, random peptide 50 amino acid long libraries have been designed and selected for several characteristics by phage display technique. To display the protein libraries we created 3 different phagemid systems, improving vectors used in previous experiments. The main improvements have been in the increase of efficiency in the library cloning and in the phage production steps. In addition, in the new vectors a His-tag replaced the old tag (a c-myc tag recognized by MAb 9E10 antibody). This involved a change of the purification system, in fact His-tagged proteins can be identified by Immobilized metal affinity chromatography (IMAC), whose efficiency is higher than antibody purification. The complexity degree of phagemid libraries was estimated at 107 different sequences per ml. This complexity degree is a good compromise between a wide space of sequences and a good number of copies of each sequence. According to the production of phage libraries, by a 3+3 monovalent phage system we obtained phage particles with the phagemid incapsidated and a single NBP fused to the minor capsid protein (pIII protein). The first selection aim has been to look for three-dimensional structure using the resistance to thrombin digestion as folding criterion. All random sequences have in the middle a PRG (proline-arginine-glycine) site, corresponding to a thrombin cleavage site. Folded sequences preserve PRG during thrombin digestion, while unfolded sequences are cut since PRG is exposed to enzyme cleavage. To recover His-tagged sequences undigested by thrombin we chose the Ni-affinity purification, using ELISA Ni-coated plates. Results obtained after the second biopanning cycle showed a high proportion of resistant sequences (around 103 cfu/ml, the starting phage titre of 108 cfu/ml), indicating a good chance to select folded NBPs. Performed controls confirmed the results excluding un-specific bonds. In parallel, a probable catalytic activity was tested, screening phage libraries against a TSA target, which mimics the transition state of an amide bond hydrolysis. The aim of this selection is that a molecule which binds the transition state during a reaction can catalyze this reaction, lowering the activation energy. Therefore, selected NBPs could catalyze amide bond hydrolysis reaction. The procedure implied the selection of the phage library on a solid surface coated with the TSA. TSA was immobilized on the plate by a covalent bond between the acid group of TSA and secondary amine on the plate. In addition, we tested the influence of a metallic cofactor (Zinc) on affinity between NBPs and the target. A good amount of phage library was recovered from wells coated with TSA (around105 cfu/ml, the starting phage titre of 109 cfu/ml). The metal cofactor did not seem to affect the affinity for the target, in fact the phage quantity recovered from the plate was similar both with and without Zn. Performed controls excluded un-specific bonds between capsid proteins and TSA and between NBPs and reagents used for TSA coupling. Un-specific bonds with plate were excluded too. The last selection was to test possible interactions between NBPs and other proteins and investigate their possible use like inhibitors/activators of the target proteins. The basic idea of this selection is that a ligand, to act as an inhibitor/ activator of a protein, first of all, has to bind such protein. Chosen targets were 4 proteases: papain, pepsin, trypsin and α- chymotrypsin. They were immobilized on a polystyrene plate by adsorption. To avoid possible bounds between phage and plate surface, wells were incubated also with BSA. Already after the second cycle, the distribution of selected phage is different for the 4 proteases: the number of phage from papain- and pepsin- wells is higher than those for the other proteases, in particular trypsin. Performed controls excluded un-specific bonds between capsid proteins and each protease. Un-specific bond with BSA were excluded too. The possibility of finding folded random proteins might suggest that folding is not a special property to be selected by Nature. This point could be taken as favouring the contingency hypothesis. Also the probability to find new sequences with a potential activity supports the idea that there may be an entire universe of possible proteins, with unknown properties.Il mio lavoro di dottorato fa parte del progetto Never Born Proteins. Questo progetto si basa sul concetto che le proteine esistenti sulla Terra sono solo una frazione infinitesimale di tutte le sequenze possibili. Per spiegare il rapporto tra le proteine esistenti e possibili, possiamo dire che il rapporto tra di esse corrisponde al rapporto tra il deserto del Sahara e un singolo granello di sabbia. Dato il gran numero di possibili sequenze, la Natura non avrebbe potuto esplorare tutte le possibili combinazioni di amminoacidi. Pertanto, siamo di fronte al problema di come le "poche" proteine esistenti sono state prodotte e/o selezionate: le proteine esistenti hanno particolari proprietà chimicofisiche (come solubilità, struttura terziaria, funzionalità, stabilità termodinamica) che hanno reso inevitabile la loro selezione? O piuttosto sono il frutto della contingenza? Se fossero il risultato della contingenza, esisterebbe allora un universo di proteine con proprietà mai testate dalla natura: le Never Born Proteins - NBP. Per esplorare il mondo delle NBPs, librerie codificanti peptidi di 50 aminoacidi a sequenza casuale sono state progettate e poi selezionate per diverse caratteristiche con la tecnica del phage display. Per esprimere le librerie abbiamo creato 3 diversi sistemi fagemidici, migliorando alcuni vettori utilizzati in precedenti esperimenti. I principali miglioramenti hanno riguardato un aumento dell’efficienza nel passaggio di clonazione della libreria e nella fase di produzione dei fagi. Inoltre, i nuovi vettori possiedono un His-tag al posto del vecchio tag (un c-myc tag riconosciuto dall’anticorpo MAb9E10). Ciò ha comportato un cambiamento del sistema di purificazione, infatti le proteine legate ad un His-tag possono essere identificate anche tramite cromatografia di affinità (Immobilized metal affinity chromatography - IMAC) la cui efficienza è superiore alla purificazione con anticorpi. Il grado di complessità delle librerie fagemidiche è stato stimato 107 sequenze diverse per ml. Questo grado di complessità è un buon compromesso tra un ampio spazio delle sequenze e un buon numero di copie di ciascuna sequenza. Per quanto riguarda la produzione delle librerie fagiche, tramite un sistema fagico monovalente 3+3 abbiamo ottenuto particelle fagiche con il fagemide incapsidato e una singola NBP fusa alla proteina minore del capside (la proteina pIII). L'obiettivo della prima selezione è stato quello di cercare strutture tridimensionali utilizzando come criterio di folding la resistenza alla digestione da parte della trombina. Tutte le sequenze casuali possiedono nella regione centrale un sito PRG (prolina-arginina-glicina), corrispondente ad un sito di taglio per trombina. Le sequenze strutturate proteggono il PRG dal taglio della trombina, mentre in quelle non strutturate il PRG è esposto alla digestione dell’enzima. Per recuperare le sequenze legate all’His-tag e non tagliate dalla trombina abbiamo scelto la purificazione mediante affinità al Ni, utilizzando piastre ELISA ricoperte di Ni. I risultati ottenuti dopo il secondo ciclo di biopanning hanno mostrato un’elevata quantità di sequenze resistenti (circa 103 cfu/ml con un titolo di incubazione iniziale pari a 108 cfu/ml), ciò indica una buona possibilità di selezionare NBPs foldate. I controlli fatti hanno confermato i risultati escludendo legami aspecifici. In parallelo le NBPs sono state testate anche per una possibile attività catalitica, selezionando le librerie fagiche contro un TSA, che mima lo stato di transizione della reazione di idrolisi del legame ammidico. L’idea di base di questa selezione è che una molecola che lega lo stato di transizione durante una reazione può catalizzare questa reazione, abbassando l'energia di attivazione. Pertanto, le NBPs selezionate potrebbero catalizzare l’idrolisi del legame ammidico. La procedura implica la selezione della libreria dei fagi su una superficie solida rivestita con il TSA. Il TSA è immobilizzato su una piastra mediante un legame covalente tra il suo gruppo acido e l’ammina secondaria della piastra. Abbiamo anche verificato l'influenza di un cofattore metallico (zinco) sull’affinità di legame tra le NBPs e il TSA. Una quantità importante della libreria fagica è stata recuperata dai pozzi rivestiti con il TSA (circa 105 cfu/ml con un titolo di incubazione iniziale pari a 109 cfu/ml). Il cofattore metallico non sembra influenzare l'affinità per il target, infatti la quantità dei fagi recuperati dalla piastra è simile sia con che senza Zn. I controlli fatti hanno escluso legami aspecifici tra le proteine del capside e il TSA e tra le NBPs e i reagenti utilizzati per il coupling del TSA. Sono stati esclusi anche legami aspecifici con la piastra. L'ultima selezione è stata effettuata per verificare le possibili interazioni tra le NBPs e altre proteine ed indagare il loro possibile uso come inibitori/attivatori delle proteine bersaglio. L'idea di base di questa selezione è che un ligando per agire come inibitore/attivatore di una proteina, prima di tutto, deve legare tale proteina. I targets scelti sono stati 4 proteasi: papaina, pepsina, tripsina e α- chimotripsina. Esse sono stati immobilizzati su una piastra di polistirene tramite adsorbimento. Per evitare possibili legami tra fagi e la superficie della piastra, i pozzetti sono stati incubati anche con BSA. Già dopo il secondo ciclo, la distribuzione dei fagi selezionati è diversa per le 4 proteasi: il numero di fagi recuperati dai pozzetti con papaina e pepsina è superiore a quello per le altre proteasi, in particolare la tripsina. I controlli fatti hanno escluso legami aspecifici tra le proteine del capside e ogni proteasi. È stato escluso anche il legame aspecifico con la BSA. La probabilità di trovare proteine a sequenza casuale con una struttura terziaria potrebbe suggerire che il folding non è una proprietà necessaria per essere selezionato dalla Natura. Questo punto potrebbe andare a favore della teoria della contingenza. Anche la probabilità di trovare nuove sequenze con una potenziale attività sostiene l'idea che ci possa essere un intero universo di possibili proteine, con proprietà sconosciute