Plant production of virus-like particles for vaccine formulation

Obiettivo di questa tesi di dottorato è la produzione in pianta, di particelle simil-virali (Virus Like Particle, VLP) chimeriche, derivate dal virus dell’Arricciamento Maculato del Carciofo (AMCV), che espongono sulla loro superficie epitopi immunogenici. La realizzazione di tale progetto ha previsto un approccio combinato tra studi in silico (simulazioni matematiche al computer) e ricerca sperimentale. Nella fase iniziale del progetto, la sequenza codificante per la proteina del capside virale (CP) dell’AMCV è stata clonata in differenti vettori d’espressione transiente allo scopo di selezionare quello in grado di fornire il più alto livello di proteina esogena. La produzione della proteina virale, in piante di Nicotiana benthamiana (N.benthamiana), è stata valutata mediante saggi immunoenzimatici (ELISA). La capacità della CP di auto-assemblarsi in VLP è stata verificata mediante microscopia elettronica. La scelta degli epitopi immunogenici da fondere alla CP per l’ottenimento di VLP chimeriche, si è focalizzata su regioni altamente conservate appartenenti alle glicoproteine (gp) 41 e gp120 della membrana esterna del virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (Human Immunodeficiency Virus, HIV-1). In particolare sono stati scelti, l’epitopo 2F5 della gp41 ed il loop V3 della gp120, in grado di indurre una risposta immunitaria neutralizzante nell’uomo. In seguito, è stato realizzato il modello in silico della VLP wild type (WT). Questa elaborazione bioinformatica è stata di fondamentale importanza per l’individuazione di siti utili all’inserimento di sequenze eterologhe, codificanti per i peptidi immunogenici all’interno della CP virale senza interferire con il corretto assemblaggio delle VLP. Una volta caratterizzata in silico la VLP-WT, sono stati realizzati i modelli bioinformatici relativi alle VLP chimeriche. Sulla base delle indicazioni fornite dagli studi teorici, sono stati ideati e realizzati i costrutti necessari per l’espressione transiente delle CP chimeriche, la cui produzione è stata valutata mediante saggi ELISA e microscopia elettronica. Parte del lavoro di questa tesi si è anche focalizzato su studi volti ad individuare quali fossero i principali fattori responsabili della stabilità dei virioni e di conseguenza delle VLP derivate dall’AMCV. In particolare, sono stati presi in considerazione la variazione delle interazioni tra molecole di CP e tra CP e RNA in differenti condizioni di pH, forza ionica e diverse concentrazioni di cationi divalenti.The aim of this thesis project is the production of chimeric plant virus-like particles (VLP), displaying immunogenic epitopes on the outer surface, derived from the Artichoke Mottled Crinkle Virus (AMCV), a member of genus Tombusvirus. The project was carried out following a combined approach consisting of computational and experimental virology. The first step of the project was to verify the capability of AMCV coat protein (CP), expressed in plant tissues, to self-assemble into VLP. For this purpose the cp gene was expressed in Nicotiana benthamiana (N.benthamiana) leaves by an Agrobacterium mediated transient expression system boosted by the AMCV p19 silencing suppressor. The production of viral protein was evaluated by ELISA immunoassays and its ability to self-assemble into VLP was verified by electron microscopy. Concerning the choice of immunogenic epitopes, we focused on highly conserved regions belong of glycoprotein (gp) 41 and gp120 of the human immunodeficiency virus type 1 (Human Immunodeficiency Virus, HIV-1) envelope. Two neutralising epitopes were chosen, the 2F5 of gp41 and the V3 loop of gp120. Thereafter, it was designed in silico model of the wild type VLP. This bioinformatics model has been of fundamental importance for the identification of useful sites for the insertion of heterologous sequences, coding for immunogenic peptides (epitopes) within the viral CP without interfering with the assembly of the VLP. After the characterization of the in silico wild type VLP, the bioinformatics models of chimeric VLP were performed. Following the computational analysis results, the expression cassettes containing the genes encoding chimeric CP were done. Expression and assembly of chimeric CP were evaluated by ELISA and electron microscopy. 2 In addition, part of the work was focused on the identification of the main factors responsible of the virion stability. In particular, we studied the variation of the interactions between CP molecules and between CP and RNA under different conditions of pH, ionic strength and different concentrations of divalent cations.Dottorato di ricerca in Biotecnologie vegetal