Non-invasive diet analysis based on DNA Barcoding: the Himalayan Brown Bears (Ursus arctos isabellinus) as a case study

The study of food webs and their dynamics is fundamental to understand how the feeding habits of the different species can affect the community, thus improving our understanding of the functioning of the ecosystem as a whole. Furthermore, the study of feeding ecology becomes crucial when it concerns endangered species since a precise knowledge of their diet is to be gathered when designing reliable conservation strategies. A wide range of methodologies have been proposed for diet analysis, including simple ones, as visual observation of foraging behavior, and more complex ones such as Near Infrared Reflectance Spectroscopy and DNA based methods. DNA barcoding, i.e. species identification using a standardized DNA region or markers, has recently received much attention and is being further developed through an international initiative called "Consortium for the Barcode of Life". When using DNA barcoding for diet analysis, the choice of the markers is crucial. The ideal DNA barcoding marker should meet several criteria. It should be variable among species, standardized, with enough phylogenetic information, extremely robust, and short enough to allow amplification of degraded DNA. In this study we propose the trnL (UAA) intron as marker for plant DNA barcoding. The power and the limitations of this system were evaluated as well as the possibility of species identification with highly degraded DNA. The main limitation of this system is its relatively low resolution in discriminating closely related species. Despite the relatively low resolution, it has many advantages: the primers are highly conserved, the amplification system is very robust and it is able to work with much degraded DNA samples. This system has been coupled with massively parallel pyrosequencing technique. We demonstrate the efficiency of this new approach by analyzing the diet of various herbivorous species. The whole chloroplast trnL (UAA) intron (254–767 bp) and a shorter fragment of this intron (the P6 loop, 10–143 bp) were used in this study. For the whole trnL intron 67.3% of the species retrieved from GenBank were unambiguously identified and 19.5% for the P6 loop. The resolution is much higher after calibration of specific contexts using species originating from the same ecosystem. Furthermore, the trnL approach was coupled with individual and sex identification using microsatellites polymorphism in the Himalayan brown bear (Ursus arctos isabellinus). Among world brown bears populations; those in Asia are the most ii endangered and least studied. Here, populations have declined by more than half in the past century owing to habitat loss and fragmentation and human activity. Presently in Pakistan brown bear occur sparsely in seven small populations, with the largest isolate in the Deosai National Park. We examined this population using a combination of fecal DNA analysis and field data for which geographical location and date of sampling were available, with the aim to study individual and sexual differentiation in the diet, and also temporal and geographical variations. Twenty-eight individuals (16 male, 10 females and 2 unknown sex) were identified in this study with microsatellites markers. Only eight plant species were found represented in more than 50% of individual feces. Temporal differences were found with more energetic food detected before the hibernation periods.Lo studio delle reti trofiche e della loro dinamica è fondamentale per comprendere come le abitudini alimentari delle diverse specie possono incidere sulla comunità, migliorando in tal modo la nostra comprensione sul funzionamento dell'ecosistema nel suo complesso. Inoltre, lo studio dell’ecologia dell’alimentazione diventa cruciale quando si tratta di specie in via d’estinzione, nelle quali una precisa conoscenza della loro dieta deve essere acquisita per definire una strategia di conservazione di successo. Una vasta gamma di metodi é stata proposta per l’analisi della dieta, che vanno da quelli più semplici, come osservazione visiva dell’animale durante il pasto, a quelli più complessi, come la Near Infrared Reflectance Spectroscopy e i metodi basati sul DNA. Il DNA barcoding, cioè l’identificazione di attraverso una regione standardizzata di DNA o attraverso marcatori, ha recentemente ricevuto molta attenzione e si è ulteriormente sviluppato attraverso un'iniziativa del consorzio internazionale denominato "Consortium for Barcoding of Life". Quando si usa il DNA barcoding per l'analisi della dieta, la scelta dei marcatori è cruciale. Il marcatore ideale per il DNA barcoding deve soddisfare diversi criteri. Deve essere variabile tra specie, standardizzato, avente una sufficiente informazione filogenetica, molto robusto, e abbastanza corto da consentire l'amplificazione di DNA degradato. In questo studio si propone l'introne trnL (UAA) come marcatore per il DNA barcoding delle piante. I vantaggi e gli svantaggi di questo sistema sono stati valutati come pure la possibilità di identificare di specie da DNA molto degradato. Il limite principale di questo sistema è la sua relativamente bassa risoluzione in discriminare specie filogeneticamente molto simili. Nonostante la relativa bassa risoluzione, il sistema ha molti vantaggi: i primers sono molto conservati, il sistema di amplificazione è molto robusto ed è in grado di funzionare con campioni di DNA molto degradati. Questo sistema è stato accoppiato con la tecnica di pirosequenziamento parallelo. Abbiamo dimostrato l'efficacia di questo nuovo approccio analizzando la dieta di varie specie d’erbivori. L'intero introne trnL (UAA) del cloroplasto (254-767 pb) e un breve frammento di questo introne (il P6 loop, 10-143 pb) sono stati utilizzati in questo studio. Per l'intero introne trnL, il 67,3% delle specie, recuperate da GenBank, sono statie indentificate in modo inequivocabile e 19,5% per il P6 loop. La risoluzione è molto più elevata dopo la calibrazione in contesti specifici utilizzando specie originarie dello stesso ecosistema. vi Inoltre, il trnL approach è stato condotto in parallelo con identificazione degli individui e del sesso dell’animale tramite microsatelliti nell’orso bruno imalaiano (Ursus arctos isabellinus). Tra le popolazioni d’orso bruno al mondo, quelle in Asia sono le più minacciate e meno studiate. Qui, le popolazioni sono diminuite di oltre la metà nel secolo passato, a causa della frammentazione, la perdita di habitat e le attività umane. Attualmente in Pakistan, l’orso bruno è presente in sette piccole popolazioni isolate, con la più grande nel Parco Nazionale del Deosai. Abbiamo esaminato questa popolazione utilizzando una combinazione d’analisi di DNA da feci e di dati di campo per i quali la localizzazione geografica e la data di campionamento erano disponibili, con l'obiettivo di studiare differenze nella dieta a livello individuale tra i due sessi, e anche variazioni geografiche e temporali. Ventotto individui (16 maschi, 10 femmine e 2 di sesso sconosciuto) sono stati identificati in questo studio con i marcatori microsatelliti. Solo otto specie di piante sono state trovate rappresentate per oltre il 50% degli individui. Differenze temporali sono state riscontrate, con un consumo di cibo più energtico prima del periodo del letargo.L'étude des réseaux trophiques et leur dynamique est fondamentale pour comprendre comment les habitudes alimentaires des différentes espèces peuvent influencer la communauté, afin d'améliorer notre compréhension du fonctionnement de l'écosystème dans son ensemble. En outre, l'étude de l'écologie alimentaire devient cruciale lorsqu'il s'agit des espèces en voie de disparition, une connaissance précise de leur alimentation doit être acquise lors de la conception des stratégies de conservation. Un large éventail de méthodes a été proposé pour l’analyse du régime alimentaire, y compris les plus simples, comme l'observation visuelle du comportement d’alimentation, et les plus complexes, comme la spectrométrie dans le proche infrarouge et les méthodes basées sur l'ADN. "DNA barcoding" (Code barre d’ADN), c'est-à-dire l'identification des espèces en utilisant une région standardisée d'ADN ou des marqueurs standardisés, a récemment reçu beaucoup d'attention et est actuellement développé grâce à une initiative internationale appelée "Consortium for The Barcoding of Life". Lors de l'utilisation du "DNA barcoding" pour le régime alimentaire, le choix des marqueurs est crucial. Le marqueur idéal pour le "DNA barcoding" doit satisfaire plusieurs critères. Il doit être variable entre les espèces, standardisé, avec suffisamment d'informations phylogénétiques, très robuste, et suffisamment court pour permettre l'amplification de l’ADN dégradé. Dans cette étude, nous proposons l’intron trnL (UAA) en tant que marqueur pour le "DNA barcoding" des plantes. Le pouvoir et les limites de ce système ont été évalués, ainsi que la possibilité d'identification des espèces avec de l'ADN fortement dégradé. La principale limitation de ce système est la relative faible résolution de discrimination des espèces très proches. En dépit de la résolution relativement faible, elle présente de nombreux avantages: les amorces sont hautement conservées, le système d'amplification est très robuste et il est capable de travailler avec des échantillons d'ADN très dégradés. Ce système a été couplé avec la technique du pyroséquençage. Nous avons démontré l'efficacité de cette nouvelle approche par l'analyse de l'alimentation de différentes espèces herbivores. L'ensemble des introns chloroplastique trnL (UAA) (254-767 pb) et d'un court fragment de cet intron (P6 boucle, 10-143 pb) ont été utilisés dans cette étude. Pour l'ensemble de l’intron trnL, 67,3% des espèces récupérées à partir de GenBank ont été identifiées sans ambiguïté et 19,5% pour la P6 boucle. La résolution iv est beaucoup plus élevée après calibration sur des contextes spécifiques en utilisant des espèces originaires d'un même écosystème. En outre, l’approche par le trnL a été associée à l'identification individuelle et le sexe en utilisant le polymorphisme de microsatellites dans l’ours brun himalayen (Ursus arctos isabellinus). Parmi les populations mondiales d'ours bruns, celles d’Asie sont les plus menacées et les moins étudiées. Ici, les populations ont diminué de plus de moitié au cours du siècle dernier en raison de la perte d'habitats, de sa fragmentation et de l'activité humaine. Actuellement, au Pakistan l'ours brun existe dans sept petites populations isolées, dont la plus grande est située dans le Parc National du Deosai. Nous avons examiné cette population au moyen d'une combinaison de l'analyse d'ADN des fèces et de données de terrain pour lesquelles les coordonnées géographiques et la date de prélèvement étaient disponibles, pour étudier la différenciation sexuelle et individuelle du régime alimentaire, ainsi que les variations temporelles et géographiques. Vingt-huit individus (16 mâles, 10 femelles et 2 de sexe inconnu), ont été identifiés dans cette étude avec les marqueurs microsatellites. Seulement huit espèces de plantes ont été trouvées représentées dans plus de 50% des fèces des individus. Des différences temporelles ont été trouvées, avec une alimentation plus énergétique avant la période d'hibernation.Dottorato di ricerca in Ecologia e gestione delle risorse biologich