Role of Apoptosis in the final outcome of DNA damage

Damage to DNA is intrinsic to life, as the cell continuosly suffers from numerous exogenous agents, including radiation and chemicals, and from endogenous sources, such as free radicals generated during essential metabolic processes. The broad spectrum of DNA lesions induced by these agents includes damage to nucleotide bases, DNA protein crosslinks and DNA single- and double-strand breaks (DBSs). Because of their high cytotoxicity (unrepaired or misrepaired DNA DSBs can kill a cell) and their ability to induce chromosomal aberrations (that may ultimately lead to carcinogenesis) cell survival and mantenaince of genome integrity are critically dependent on efficient repair of DNA DSBs. When the burden of genomic insult is too large to be effectively repaired, cells are able to initiate apoptosis (programmed cell death). On the basis of these considerations, the aim of this thesis has been to investigate the role of apoptosis in the final outcome of DNA damage. Since G0 lymphocytes are the most common tissue used in biodosimetry studies, and the amount of chromosomal damage detected depends on the time between exposure and sampling, it was of interest to investigate the relationship between the frequencies of radiation induced chromosomal aberrations and the extent of apoptosis in G0 human lymphocytes (Paper I). In human lymphocytes irradiated in G0 without subsequent stimulation to proliferate, a p53-dependent apoptotic pathway preferentially eliminates cells bearing unstable aberrations. Studies in Paper II demonstrated that in human lymphocytes the type of chromosome damage influences the induction of programmed cell death and provided direct evidence that cells bearing dicentric chromosomes are eliminated by apoptosis. The lymphocytes undergo apoptosis during storage, and this loss of viability is accelerated by increasing both temperature and storage time, was demonstrated in Paper III. Studies on the effects of storage conditions of whole blood on the viability and proliferation of lymphocytes revealed optimal the storage at 4°C for 96 h in the presence of phytohaemagglutinin. The influence of genetic background on the induction of apoptosis in cells of different origin, treated with a potential anticancer drug “STDS2323”, was studied in Paper IV. In conclusion, this thesis suggests that apoptosis has an important role in the final outcome of DNA damage. The thesis further suggests that these results may have relevance for biodosimetrical and molecular epidemiological studies and in evaluations of the efficacy of radio- and chemotherapy.Il DNA è sottoposto continuamente ad alterazioni strutturali da parte di agenti sia esogeni che endogeni. Le radiazioni ionizzanti (IR) sono tra i più importanti agenti fisici che hanno sulle cellule bersaglio un effetto citotossico, mutageno e cancerogeno. Il danno indotto al DNA consiste principalmente in rotture a singola e doppia elica, legami crociati DNA-proteine e modificazioni delle basi. Le rotture a doppia elica (DSBs) sono le lesioni più dannose per la cellula. Tutti gli organismi hanno evoluto diversi meccanismi per riparare le rotture al DNA. L’effetto delle DSBs può essere osservato principalmente con la produzione d’aberrazioni cromosomiche in cellule in divisione, la cui formazione è data soprattutto da un’errata (misrepair) o mancata (unrepair) riparazione; oppure con l’apoptosi (morte cellulare programmata) la cui induzione è data da un danno troppo complesso perché sia riparato. In conformità a queste osservazioni, lo scopo di questa tesi è stato quello di comprendere il ruolo dell’apoptosi nella manifestazione finale del danno al DNA. Poiché i linfociti quiescenti sono il tessuto più comunemente usato in biodosimetria e il danno cromosomico dipende dal tempo che trascorre dopo l’esposizione “in vivo” alla radiazione, è stato interessante investigare la relazione tra l’induzione di aberrazioni di tipo instabile e l’induzione dell’apoptosi, nei linfociti umani in G0 (Paper I). Nei linfociti umani irradiati in G0 e tenuti per vario tempo in questa fase, un “pathway” apoptotico p53 dipendente elimina preferenzialmente le cellule portatrici di aberrazioni di tipo instabile. Gli studi condotti in “Paper II” hanno dimostrato che, nei linfociti umani in G0 ,il tipo di danno cromosomico influenza l’induzione del processo apoptotico e che esiste un ruolo diretto dell’apoptosi nell’eliminare le cellule portatrici di cromosomi dicentrici. In “Paper III” è stato dimostrato che i linfociti muoiono durante la conservazione (storage) e questa perdita di vitalità è accelerata dall’aumento sia della temperatura che il tempo di conservazione. Studi condotti sull’effetto delle condizioni di conservazione del sangue intero, sulla vitalità e la proliferazione dei linfociti, hanno rilevato che la condizione ottimale di conservazione è quella a 4°C per 96 h ed alla presenza del mitogeno “phytohaemagglutinin”. L’influenza del “background” genetico cellulare nell’induzione dell’apoptosi è stata studiata (Paper IV) in cellule di diversa origine trattate con un potenziale farmaco antitumorale “STDS2323”. In conclusione, questa tesi suggerisce un ruolo importante dell’apoptosi nella manifestazione finale del danno al DNA. Inoltre la tesi suggerisce una rilevanza dei risultati ottenuti in studi di dosimetria biologica e di epidemiologia molecolare e nella valutazione dell’efficacia di una radio- o chemioterapia antitumorale.Dottorato di ricerca in Evoluzione biologica e biochimic