Proteomic approach for studying the cadmium pollution effects on Spinacia Oleracea L. plants

Lo scopo principale è stato quello di osservare gli effetti del Cd sul primo anello della catena alimentare, cioè la pianta, mediante un approccio proteomico e di cercare di fare chiarezza su fenomeno molto dibattuto in letteratura, ma con risultati a volte contraddittori. È risaputo, comunque, che il Cd è facilmente assorbito dalle radici, tramite le quali raggiunge le parti aeree della pianta dove viene accumulato ad alte concentrazioni. Una volta assorbito, è stato osservato come il Cd possa interferire a livello fotosintetico sia con fotosistema I sia con il fotosistema II, evidenziando una marcata specie-specificità del fenomeno. A livello macroscopico è stato possibile osservare, in accordo con la letteratura, come il Cd riduca enormemente la crescita dell’intera pianta e induca una marcata clorosi sulle foglie di Spinacia Oleracea L. facendo una differenziazione tra foglie apicali e basali, dove le prime rimangono verdi come le piante controllo, mentre le seconde mostrano clorosi. Con l’andare avanti del trattamento è stata notata anche la comparsa di necrosi, dapprima sulla punta della foglia basale per poi estendersi sull’intera superficie della pianta. Questo effetto macroscopico va in contrasto con alcuni studi fatti su altre piante (Kieffer et al., 2008), ma è a conferma di come l’azione del Cd sia specie-specifica. Quindi osservati tali effetti a livello macroscopico, abbiamo voluto indagare gli effetti del Cd dapprima a livello fotosintetico facendo sempre una distinzione tra foglie apicali e basali, in quanto hanno mostrato una diversa risposta al trattamento con il metallo pesante. Come tecniche di analisi e come parametri di riferimento sono stati usati un approccio proteomico tramite BN-PAGE e gradiente di saccarosio e l’analisi dei pigmenti fotosintetici. Il BN-PAGE in prima e seconda dimensione ci permette di avere una visione d’insieme di tutti i supercomplessi fotosintetici, le relative variazioni ed, inoltre, è una tecnica altamente riproducibile. Mentre il gradiente di saccarosio ci permette di separare i supercomplessi in varie bande che successivamente possono essere iniettate in HPLC on-line con uno spettrometro di massa per una successiva separazione e identificazione di ogni singola proteina di ogni supercomplesso. Tale tecnica, quindi, ci permette di analizzare ogni singola variazione di sintesi di ogni singola proteina di tutti i supercomplessi della membrana tilacoidale. I pigmenti fotosintetici sono un altro parametro fondamentale per monitorare lo stato di salute di una pianta. L’analisi è stata effettuata mediante l’utilizzo della tecnica RP-HPLC con detector diode array UV-VIS. È stato possibile, quindi, non solo separare e analizzare semi-quantitativamente ogni singolo pigmento, ma è stato possibile osservarne anche il relativo spettro di assorbimento, per una identificazione inequivocabile. Avendo notato tramite gradiente di saccarosio come le proteine antenna lchb 1.1 fossero maggiormente inibite dal trattamento, abbiamo voluto controllare anche le variazioni di sintesi dei trascritti delle proteine suddette mediante RT-PCR. Inoltre sono state analizzate anche le piante cresciute con ioni bivalenti in eccesso nelle soluzioni di crescita, per verificare se il Cd si sia sostituito ai cofattori bivalenti nella trascrizione. Visti i notevoli effetti del Cd sulla pianta a livello macroscopico che sui tilacoidi, abbiamo voluto indagare se gli effetti del Cd siano reversibili. Infatti è stato allestito un esperimento di “recovery”, dove non solo è stato rimosso il Cd, ma sono stati aggiunti alle soluzioni di crescita ioni bivalenti come Zn, Mg etc., per vedere quale ione fosse stato sostituito nei fattori di trascrizione. Una volta analizzati gli effetti a livello tilacoidale, il nostro scopo si è incentrato sulla determinazione delle proteine differenzialmente espresse in tutto l’estratto fogliare, mediante la tecnica 2D IEF-SDS-PAGE. Anche in questo caso sono state separate le foglie basali da quelle apicali, vista la marcata clorosi delle prime, ed inoltre è stata seguita una cinetica di trattamento, per osservare gli effetti del Cd sulla foglia spingendoci a lunghi tempi di esposizione come 42 giorni. Una risposta immediata da parte delle piante allo stress da Cd è la produzione di fitochelatine. Questi composti sono dei piccoli peptidi, formati da glutammato, cisteina e glicina, anche se in natura si possono trovare altre forma isomeriche dove al posto della glicina si possono sostituire altri aminoacidi. La funzione di tali composti è di chelare il Cd, presente nel citosol, e renderlo innocuo, trasportandolo nei vacuoli. Un’analisi semi-quantitativa di tali composti è indice della presenza di Cd o meno all’interno della foglia. Quantificare la presenza delle varie forme di fitochelatine nelle foglie basali e apicali è stato un ulteriore “target” di questa tesi. Per completare l’intera analisi sulla pianta, sono state analizzate anche le radici trattate con il Cd sia mediante un approccio proteomico, che mediante un approccio metabolomico, tramite spettroscopia NMR e RP-HPLC on line con lo spettrometro di massa. In questa tesi, comunque, non verrà presentato nessun dato a tal riguardo, in quanto la nostra ricerca è ancora ad una fase di indagine preliminare.The changes induced in the photosynthetic apparatus of spinach (Spinacia oleracea L.) leaves upon addition of cadmium to hydroponics solution were characterized. Two proteomic approaches coupled with chlorophyll, xanthophylls and phytochelatins analysis and in vivo measurements of photosynthesis were used. Cadmium only accumulated in basal leaves, that were therefore used for assessment of Cd-induced changes. Cadmium strongly reduced chlorophyll concentration in leaves, especially chlorophyll a. Lutein, neoxanthin and violaxanthin increased during the treatment but no zeaxanthin and anteraxanthin were produced, indicating that the violaxanthin-zeaxanthin de-epoxidation cycle was impaired by Cd. Cadmium reduced significantly the amount of antenna proteins of PSI, while PSII antennae were affected to a minor extent, with exception of the isomeric Lhcb1.1 which decreased significantly already at the onset of the treatment. Cytochrome b6/f and the ATP-synthase complex did not change following the Cd treatment. No new protein was formed and no specific protein disappeared in the photosynthetic apparatus of Cd-treated leaves, while an increasing amount of phytochelatins was recorded over time. Fluorescence analysis revealed that Cd damage to photosystems only influences photosynthesis when light intensity drives high rates of electron transport, which in turn require large rates of RuBP regeneration. Upon removal of Cd, a rapid re-synthesis of both chlorophylls was detected, lutein decreased again and a significant re-synthesis of Lhcb1.1 antenna was observed, especially in the presence of zinc. The hypothesis is put forward that Cd affects aspecifically the photosynthetic apparatus of spinach basal leaves, replacing other metal ions inside proteins. Plants do not react by specific mechanisms but localize Cd into the basal leaves by an over-production of phytochelatins which avoid Cd diffusion to expanding leaves. Chlorosis develops in Spinacia Oleracea L. plants exposed to Cd, but symptoms differ from those seen during Fe deficiency, as they are prevalently localized in the basal leaves. A proteomic comparison of basal and apical leaves from Cd treated plants showed modified profiles that are different and complementary in the two locations. Total chlorophyll increased in apical leaves as did photosynthetic complexes and enzymes involved in CO2 fixation and carbohydrate metabolism. Thus apical leaves seem to supply the plant’s energy requirements and, consistent with this, remain green after 40 days. In contrast, basal leaves experienced reduced chlorophyll a synthesis and photosynthesis, and later on an over production of ROS, which induces a cell defence response, leading to senescence and cell death. There was also over production of GSH and phytochelatins, whose main role is in chelating Cd. These chelate–polypeptide complexes accumulate in the vacuole, limiting the distribution of Cd to apical leaves. On line we found that many proteins involved in carbon metabolism were less abundant, while proteins involved in remobilizing carbon from other energy sources were up-regulated. We suggest that phytochelatin production has priority in Cd stressed basal leaves and the nitrogen and sulphur metabolic pathways are activated for this purpose. Finally, as dead leaves detach from the plant they carry away the sequestered Cd, thereby removing it completely from the plant and preventing any future access to the apical leaves. These events may represent an active detoxification strategy in higher plants.Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellular