Cooperation between different repair system in the removal of DNA damage induced by UV-light

Nel corso della vita cellulare, il DNA è costantemente esposto ad agenti mutageni, i quali possono essere classificati a seconda della loro natura (fisica o chimica), della loro origine (endogena e esogena) o del tipo di danno che arrecano alla molecola del DNA (modificazioni di basi, legami covalenti, rotture dell’elica etc.). Il danno al DNA, qualora non adeguatamente riparato, può compromettere processi cellulari fondamentali quali, la trascrizione, la replicazione del DNA e la segregazione cromosomica e dar vita a trasformazione neoplastica (cancro) o senescenza cellulare (invecchiamento). I sistemi di riparazione del DNA svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell’integrità genomica operando a seconda del tipo di lesione e della fase del ciclo cellulare. Tra questi, il “Nucleotide excision repair” (NER) è deputato alla rimozione delle lesioni voluminose, quali quelle indotte dalla radiazione ultravioletta o da alcuni agenti chimici. Esso si avvale di due modalità distinte, sia in termini di efficienza che di velocità riparativa, a seconda che la lesione si trovi sulle regioni trascrizionalmente attive del genoma (transcription coupled repair, TCR) o sulle regioni non codificanti ( global genome repair, GGR). L’importanza di questo sistema di riparazione è dimostrata dall’esistenza di pazienti affetti da sindromi genetiche, quali lo Xeroderma Pigmentosum e la sindrome di Cockayne, le cui cellule mostrano un’elevata sensibilità alla radiazione ultravioletta. Il dimero di pirimidina (CPDs), il 6-4 fotoprodotto (6-4 PP) e in misura molto minore, l’interstrand cross-links (ICLs), costituiscono i principali tipi di danno indotto dalla radiazione ultravioletta, alla molecola di DNA, che sono responsabili sia del blocco della trascrizione del DNA e sia del blocco della forca replicativa. Nella prima fase di questo lavoro abbiamo effettuato una serie di esperimenti volti alla comprensione dell’importanza sia della riparazione per escissione di nucleotidi, sia della riparazione per ricombinazione omologa nella ripresa dell’arresto della forca replicativa provocato da lesioni indotte da radiazione ultravioletta. Il ruolo dei sistemi di riparazione NER e HR nella ripresa del blocco della forca replicativa indotta da UV, è stato studiato utilizzando linee cellulari di hamster chinese isogeniche difettive per il sistema di escissione di nucleotidi (UV4) e quello per ricombinazione omologa (irs1SF). I dati ottenuti dimostrano che il danno al DNA indotto dalle radiazioni ultraviolette provocano l’arresto della forca replicativa. Tale arresto determina l’induzione del processo apoptotico, l’attivazione sia del sistema di riparazione per ricombinazione omologa che di quello del “translesion DNA synthesis”. Inoltre la caffeina determina un cambiamento nella preferenza del meccanismo utilizzato per “by-passare” le lesioni indotte al DNA dai raggi UV. L’aumento della frequenza degli scambi tra cromatidi fratelli (SCE’s) e la diminuizione delle mutazioni puntiformi indotti dalla caffeina, in seguito ad irradiazione ultravioletta, suggeriscono l’intervento del sistema di ricombinazione omologa piuttosto che il TLS. Quindi l’effetto biologico causato dall’attivazione del processo ricombinazionale è l’induzione di aberrazioni cromosomiche, scambi tra cromatidi fratelli e regressione della forca replicativa; mentre l’attivazione del TLS provoca la formazione di mutazioni puntiformi. Nella seconda fase di questo lavoro abbiamo studiato l’importanza di fotolesioni alternative ai CPDs e 6-4 PP, come ad esempio gli ICLs, nell’induzione dell’instabilità cromosomica. Il modello di studio scelto è rappresentato da due malattie genetiche ereditarie che presentano ipersensibilità alle radiazioni ultraviolette: la sindrome di Cockayne (CS) e lo Xeroderma Pigmentosum (XP). Esistono due gruppi di complementazione per la Sindrome di Cockayne , CSA e CSB. La perfetta funzionalità di queste due proteine è legata alla riparazione dei dimeri di pirimidina indotti dagli UV sul filamento trascritto dei geni attivi, fenomeno conosciuto come riparazione accoppiata alla trascrizione o TCR. Per lo Xeroderma Pigmentosum esistono sette gruppi di complementazione, XPA-XPG. La corretta efficienza di queste proteine è collegata alla rimozione del danno indotto da UV sull’intero genoma (GGR). I pazienti affetti dall’una o l’altra sindrome presentano ipersensibilità alle radiazioni solari, neurodegenerazione ed invecchiamento precoce. A differenza dei pazienti XP, quelli CS non mostrano induzione di cancro alla pelle. Il sistema sperimentale da noi utilizzato per verificare l’effetto degli ICLs nell’instabilità cromosomica causata dall’irradiazione ultravioletta, sono linee cellulari isogeniche di hamster chinese. Precedenti studi hanno dimostrato un’elevata induzione di aberrazioni cromosomiche in seguito ad irradiazione ultravioletta nella linea cellulare UV61, omologa alla sindrome di Cockayne, se paragonata con la linea parentale AA8. Queste due linee cellulari isogeniche, differiscono sia nella rimozione dei CPDs dal filamento trascritto dei geni attivi, in particolare le AA8 sono proficienti mentre le UV61 sono difettive . Entrambe le linee cellulari non riparano i CPDs indotti nelle regione non trascritte, a causa della mutazione nel gene p48. Inoltre, sia le cellule AA8 che le UV61 riparano in maniera efficiente il 6-4 fotoprodotto sull’intero genoma. L’esigua differenza, rappresentata dal 5% dell’intero genoma, in termini di capacità di riparazione delle due linee cellulari, era in contraddizione con l’elevata differenza in termini di danno cromosomico, se non ipotizzando l’esistenza di un NER/TCR di altre fotolesioni, come ad esempio gli ICLs, o la cooperazione di diversi sistemi di riparazione nella rimozione del danno indotto da UV. Al fine di verificare tale ipotesi, abbiamo saggiato la risposta di linee difettive per il NER-TCR ad un potente induttore di ICLs, la mitomicina C. Il sistema sperimentale da noi utilizzato consiste di tre linee cellulari isogeniche di hamster chinese: AA8 (wild type), UV5 (NER-), UV61 (TCR). I dati ottenuti tramite test citogenetici (saggio di sopravvivenza, aberrazioni cromosomiche, SCE’s) e molecolari (comet assay, western blotting) hanno permesso di determinare la cooperazione di un NER-TCR degli ICLs ed un coinvolgimento diretto o indiretto della proteina CSB nell’attivazione dell’HR. I risultati ottenuti suggeriscono l’esistenza di una sinergia d’azione del “transcription coupled repair” con il sistema di riparazione per ricombinazione omologa durante la riparazione dell’interstrand cross-link.During the cellular life, the DNA is generally exposed to the mutagen agents, that they can divided by theirs nature (physics o chemistry), their origin (endogenous and esogenous) o by the different DNA damage ( base modification, covalent link, break of elix…) The DNA damage, if left unrepaired, could compromise the vital processes cellular, for example, transcription, DNA replication and cromosomic segregation and became cancer and cellular senescence. The repair system perform a fundamental role in genome maintenance operating a secondby the type of lesions and of the cell cycle phase. For example, the Nucleotide excision repair (NER) deals with the wide class of helix-distorting lesions, caused by UV-light o chemical agent. They is divided into two sub-pathway: Transcription coupled repair, focuses on damage present on the transcriptional region of the genoma, and Global genome repair surveys the entire genome for distorting injuri. The importance of this repair system is demonstrated by the existence of two syndrome. Patients affect from genetic syndromes, like Xeroderma Pigmentosum and Cockayn syndrome, showed the importance of this repair pathway. Infect cells derived from this patients have got an high sensitivity to UV-light. The highest DNA damage induced from UV-light are CPDs, 6-4PP and the inter-strand cross-links (ICLs). This type of DNA damage caused both DNA transcription arrest and replicativa fork arrest. In our preliminary study we have made experiments to understand the importance both of nucleotide excision repair, and homologues recombination pathway, in the resumption of replicativa fork arrest done to UV-light. We used isogenetic Chinese Hamster cells line defective respectively in NER and HR pathways, UV4 and irs1SF. Our data showed that DNA damage induced from UV-light caused replicativa fork arrest. This arrest induced apoptosis and the activation of both HR and transletion DNA synthesis repair pathways. The co-treatment with caffeine induced an enhanced in the frequencies of SCE and a decries in the presences of base mutations. These data showed that the repair pathway used to remove DNA damage caused from co-treatment with caffeine and UV-light are homologous recombination more then TLS. Therefore the biology effect of the recombinational repair is the induction of chromosomal aberrations, the enhanced in the frequencies of SCE and the replicativa fork retrogression, whereas the TLS activation caused base mutations. In the successive experiments we studied the relevance of photo-lesions done to ICLs, differences from CPDs and 6-4 PP, and the induction of chromosome instability. We used cells derived from patients affect to two different genetic syndromes, Cockayne syndrome (CS) and Xeroderma Pigmentosum (XP). Cockayne syndrome is caused by mutation in the CSA or CSB genes. The functionality of this two proteins is bind to the repair of pyrimidine dimer induced from UV-light in DNA transcriptional strand, transcription-coupled repair (TCR). The Xeroderma Pigmentosum disorder arises from mutations in one of seven genes (XPA-XPG). The functionality of this seven proteins is bind to the repair UV-light lesions in all the genome, global genome repair (GGR). The two syndromes patients showed high sensibility to sun radiations, neurodegenerations and premature ageing. Whereas XP patients showed a predisposition to skin cancer, this is not observed in CS patients. We used isogenetic Chinese Hamster cells line to study the effect of ICLs in the chromosomal instability caused from UV-light. Precedents study showed an high induction of chromosomal aberration after UV irradiation in UV61 cell line, Cockayne like cell line, in compare to AA8 cell line, parental cell line. These two cells line are different in the ability of repair CPDs lesions in the DNA transcriptional strand, infect the AA8 cell line are proficient, whereas the UV61 cell line are deficient in this repair pathway. Both the cells line are enable to repair the CPDs lesions in non transcriptional genome regions because they have a mutation in the p48 gene. Along both AA8 and UV61 cells line are abele to repair the 6-4 PP in all the genome. To examine this idea we tested cells line deficient in NER-TCR pathway with mitomycine C, an agent that induced ICLs. We employed three different cells line, AA8, UV5 and UV61, respectively wild type, NER deficient, TCR deficient. We made cytogenetic (Hams test, chromosomal aberrations, SCEs) and biomoleculary (comet assay, western blotting) test. Our data showed that NER-TCR attend to the repair of ICLs, that there is a direct or indirect involvement of CSB protein in the activation of HR. This results propose a synergic action of transcription couple repair and homologous repair during the inter-strand cross links repair.Dottorato di ricerca in Biologia e biochimic