Etude d'un phénomène d'extinction génique dépendant de l'homologie de séquence chez la paramécie

L'extinction génique post-transcriptionnelle, ou PTGS, est un phénomène induit après introduction d'ADN ou d'ARN double brin dans une cellule. Il se caractérise par une dégradation séquence-spécifique de tous les ARNm cellulaires homologues à l'acide nucléique étranger. Conservé des plantes aux mammifères, le PTGS constitue une réaction de défense très efficace des organismes qui peut être comparée à une sorte d'immunité génétique. Son rôle naturel serait la protection des génomes contre les éléments invasifs de type virus ou transposons. Les études effectuées jusqu'à présent ont permis de montrer que la molécule-clé permettant d'enclencher ce phénomène était de l'ARN sous forme double brin. Un des enjeux actuels consiste à comprendre comment ce type de molécule est produit après transformation par des transgènes ne présentant pas de répétition inversée en tandem. Il a été suggéré que des molécules d'ARNs de tailles aberrantes pourraient être à l'origine de la formation d'ARN double brin, en servant de matrice à une enzyme particulière : l'ARN-polymérase ARN-dépendante. L'origine de cette aberration demeure cependant inconnue. La paramécie, eucaryote unicellulaire cilié, présente également un phénomène d'extinction génique. Il se déclenche après injection dans le noyau somatique d'une grande quantité de plasmides portant uniquement la séquence codante du gène que l'on désire éteindre. Ceci aboutit à une diminution dramatique de la quantité des ARNm homologues au transgène introduit. L'une des caractéristiques de cette extinction génique est l'apparition, dans les clones éteints, d'ARNs messagers de tailles aberrantes. Mon travail de thèse a consisté dans un premier temps à mieux caractériser ce phénomène. J'ai ainsi montré qu'il s'agissait bien d'un mécanisme post-transcriptionnel pouvant être apparenté au PTGS décrit chez les autres organismes, et que des effets similaires pouvaient être observés après injection directe d'ARN double brin, ou après ingestion de bactéries produisant de l'ARN double brin. J'ai également essayé de comprendre comment étaient formées les molécules d'ARNs aberrants, afin d'en déterminer le rôle exact. Ce travail a permis de montrer que la présence dans les transgènes de la séquence 3' non codante d'un gène inhibe l'établissement du PTGS chez la paramécie. Nous avons élaboré un modèle expliquant comment l'introduction de transgènes peut déclencher ou pas l'extinction génique, via une compétition entre différentes voies métaboliques.Post-transcriptional gene silencing, or PTGS, can be induced after introduction of DNA or double-stranded RNA (RNA interference) into a cell or an organism. This leads to the sequence-specific degradation of all homologous mRNA. This phenomenon is conserved among all organisms, and can be compared to a genetic immunity system. It's natural role is to protect genomes against invasive nucleic acids, such as virus or transposons. It is now well established that the key triggering molecule is double-stranded RNA. An intriguing aspect of PTGS is to understand how these molecules are produced after transformation with DNA. Numerous studies have suggested that some aberrant RNA, produced by the transgenes, could serve as a template for an RNA-dependent RNA-polymerase to synthesize double-stranded RNA. The nature of this aberration is still a mystery. Homology-dependent gene silencing is achieved in the ciliate Paramecium by introduction of gene coding regions into the somatic nucleus at high copy number. The systematic appearance of aberrant RNA in silenced clones have prompted us to analyze the origin of these molecules, and their role in gene silencing. I have shown that introduced transgenes critically lacking 3' untranslated regions can induced efficiently gene silencing, while the presence of the 3' inhibits the establishment of the phenomenon, despite the presence of antisense RNA produced by the transgenes. The conclusion of this work is that different pathways of RNA metabolism compete for transcripts, and that the efficiencies of double-stranded RNA formation and 3' RNA processing of sense transgene transcripts determine the outcome of transformation experiments. Another part of my work was to better characterize this phenomenon. I have demonstrated that gene silencing in Paramecium can be definitively related to PTGS, and can also be induced by direct injection of double-stranded RNA, of by feeding cells with engineered bacteria expressing double-stranded RNA.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF