Détection moléculaire du parasite Cryptosporidium dans des échantillons d'eau

Cryptosporidium est un protozoaire parasite et cosmopolite responsable de nombreuses épidémies de gastro-entérites d'origine hydrique. La méthode classique de détection des oocystes de Cryptosporidium dans l'eau, basée sur un marquage immuno-fluorescent, est non spécifique de l'espèce pathogène pour l'homme C. parvum. Nous avons développé un test permettant de quantifier précisément les C. parvum issus d'échantillons d'eau par TaqMan PCR. L'ensemble de la méthode comporte une étape de filtration sur cartouche, une capture immuno-magnétique (IMS) suivie d'une lyse thermique des oocystes et d'une purification des ADN avant quantification par TaqMan PCR. La quantité est déduite d'une gamme étalon d'oocystes de quantité connue amplifiée en parallèle. Ce test spécifique permet une quantification rapide de moins de 5 jusqu'à 106 oocystes. Appliqué à des échantillons d'eaux, les rendements obtenus ont été de 69,7 % (+- 22,3) à 84,5 % (+- 9,7) pour des eaux potables et de 46,4 % (+- 7,3) à 57,6 % (+- 10,7) pour des eaux de Seine. Un second test TaqMan RT-PCR quantifiant les ARNr 18S a été développé dans le but de cibler les oocystes viables. L'adaptation du test à des échantillons d'eau a obtenu des rendements équivalents aux précédents. Afin de vérifier que les ARNr 18S peuvent être de bons marqueurs de viabilité, l'effet de traitements thermiques a été évalué par TaqMan RT-PCR. La stabilité observée des ARNr 18S a montré qu'ils pourraient ne pas être directement associés à la viabilité même s'ils se sont montrés moins stables que les ADNr 18S. Ces nouvelles méthodes pourront participer activement à optimiser le contrôle sanitaire de l'eau potable, l'efficacité des traitements de désinfection ou à identifier les ressources à risques.The protozoan parasite Cryptosporidium is known to occur widely in both raw and drinking water and is the cause of water-borne outbreaks of gastroenteritis throughout the world. The routinely used method for the detection of Cryptosporidium oocysts in water is based on an immunofluorescence assay which is non-specific for the human pathogenic species, C. parvum. We have developed a TaqMan PCR test that accurately quantifies C. parvum oocysts in water samples. The protocol consisted of the following successive steps: Envirochek® capsule filtration, immunomagnetic-separation (IMS), thermal lysis followed by DNA purification and finally real-time PCR using TaqMan technology. Quantification was accomplished by comparing the fluorescence signals obtained from test samples with those from standard dilutions of C. parvum oocysts. This IMS-TaqMan PCR assay permits rapid and reliable quantification over six orders of magnitude, with a quantification limit of 5 oocysts. Replicate samples of spiked tap water and Seine river water samples were tested and oocyst recoveries were range respectively from 69,7 % (+- 22,3) to 84,5 % (+- 9,7) and from 46,4 % (+- 7,3) to 57,6 % (+- 10,7). We also report on a TaqMan reverse transcription-PCR method that targets and quantifies C. parvum 18S rRNA for detecting viable oocysts in water. This test performed in water samples obtained similar recoveries. To study the suitability of 18S rRNA as an indicator of Cryptosporidium oocysts viability, the stability of 18S rRNA and rDNA was monitored by real-time RT-PCR following various heat treatments. Our results indicate that 18S rRNA detection may not be directly associated with viability following heat inactivation of oocysts even if in all the experiments 18S rRNA was less stable than rDNA. These new molecular methods offer a rapid, sensitive and specific alternative for C. parvum oocyst quantification in water and can be useful for better health risk assessment during routine controls of drinking water quality, evaluation of treatment efficiency as well as identification of risk resources.NANTES-BU Médecine pharmacie (441092101) / SudocSudocFranceF