Biosynthèse de l'albonoursine, un antibiotique peptidique de type dicétopipérazine produit par Streptomyces noursei (clonage de la voie de biosynthèse et caractérisation de la cyclodipeptide oxydase, une nouvelle enzyme de la famille des aminoacycle a, b-déshydrogénases)

Les métabolites dérivés des dicétopipérazines (DKP), essentiellement produits par les micro-organismes, présentent une grande diversité de structure et une large gamme d'activités biologiques (antibactérienne, antivirale, immunosuppressive ou antitumorale par exemple). Si le nombre des DKP connus augmente régulièrement, dépassant aujourd'hui plusieurs centaines, les voies de biosynthèse de ces composés restent encore largement inexplorées. Ce manuscrit présente l'isolement et l'étude de la voie de biosynthèse de l'albonoursine (cyclo(Delta-Phe-Delta-Leu)), un antibiotique peptidique de type DKP produit par Streptomyces noursei. Cette étude débute par l'isolement d'une enzyme, la cyclodipeptide oxydase (CDO), une flavoenzyme catalysant la formation des résidus alpha, bêta-déshydrogénés de l'albonoursine à partir d'un précurseur cyclodipeptidique, le cyclo(L-Phe-L-Leu), en deux étapes de déshydrogénation successives s'accompagnant de la réduction stoechioemétrique de l'oxygène moléculaire en peroxyde d'hydrogène. Le mécanisme réactionnel proposé pour CDO, qui diffère des mécanismes proposés jusqu'à présent pour la formation d'alpha, bêta-déshydroaminoacides, passerait par la formation transitoire d'une imine. Le clonage et l'analyse de la voie de biosynthèse de l'albonoursine réalisés ensuite ont permis de mettre en évidence un groupe de quatre gènes albA, albB, albC et albD. Nous avons montré que les protéines AlbA et AlbB sont nécessaires pour l'obtention de CDO active, et qu'AlbC catalyse la formation du cyclodipeptide précurseur de l'albonoursine, le cyclo(L-Phe-L-Leu). AlbD pourrait quant à elle être impliquée dans le transport de l'albonoursine. Enfin, les résultats présentés dans la dernière partie ont permis d'affiner la caractérisation structurale de CDO ébauchée dans la première partie: la forme native polymérique de CDO est constituée de la flavoprotéine covalente AlbA et de deux isoformes d'AlbB, AlbB1 et AlB2.Diketopiperazine-derived metabolites (DKP) are essentially produced by microorganisms and exhibit a large variety of structures and of biological activities (such as antibacterial, antiviral, immunosuppressive and antitumoral activities). Although the number of known DKPs is increasing steadily, biosynthetic pathways of these compounds are still largely unexplored. This manuscript presents the isolation and the study of the biosynthetic pathway of albonoursin, (cyclo(Delta-Phe-Delta-Leu)), a DKP peptide antibiotic produced by Streptomyces noursei. The study begins with the isolation of a new enzyme, the cyclic dipeptide oxidase (CDO). This flavoenzyme catalyses the formation of the alpha, beta- dehydrogenated residues of albonoursin from its cyclic dipeptide precursor, the cyclo(L-Phe-L-Leu) in two successive dehydrogenation steps. During the dehydrogenation reaction, one molecule of dioxygen is reduced into hydrogen peroxide. Finally we suggest that the reaction mechanism proceeds through the transient formation of an imine, which would differ from the mechanisms described up to now for the formation of alpha, beta-dehydroamino acids. Cloning and analysis of the albonoursin biosynthetic pathway was carried out next, allowing the identification of a cluster of four genes, albA, albB, albC et albD. We showed that the proteins AlbA and AlbB are required to obtain active CDO, and that AlbC catalyses the formation of the cyclic dipeptide precursor of albonoursin, the cyclo(L-Phe-L-Leu). As for AlbD, it could be involved in albonoursin transportation. Finally, the last results presented in this study allowed us to go further into the structural characterisation of AlbA undertaken in the first part. We showed that the native polymeric quaternary structure of CDO is constituted of the covalent flavoprotein AlbA and of two isoforms of AlbB, AlbB1 and AlbB2.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF