Sur la mise au point de dosages immunoenzymatiques de pesticides et de leurs dérivés (le cas des dithiocarbamates et de l'éthylènethiourée)

La méthode officielle utilisée à ce jour pour le dosage des résidus de dithiocarbamates consiste en une hydrolyse acide des échantillons puis, après distillation, d'un dosage spectrophotométrique du disulfure de carbone (CS2) libéré. Ce procédé présente de nombreuses limites comme une faible reproductibilité, un seuil de détection inadapté à certains dosages et une absence de spécificité. Les méthodes classiques de dosage (chromatographies gazeuse et liquide) sont elles sensibles et spécifiques, mais nécessitent un matériel coûteux, manipulé par un personnel qualifié. De ce fait, les méthodes de dosage immunoenzymatique qui permettent, en outre, de traiter plusieurs échantillons simultanément sont apparues comme une alternative pertinente aux techniques habituellement utilisées. Nos travaux décrivent, dans un premier temps, la synthèse de molécules dont la structure est identique à celle des pesticides que l'on cherche à doser. Elles possèdent en plus un bras de liaison, généralement constitué d'un enchaînement plus ou moins long de méthylènes, fonctionnalisé à son extrémité par un acide carboxylique. Ces haptènes peuvent ainsi être couplés à la surface de protéines porteuses (BSA, Ova) par la formation de liaison amide avec leurs restes lysyles. Dans un second temps, ces différents conjugués haptènes-protéine sont utilisés soit comme immunogènes pour la production d'anticorps spécifiques des pesticides considérés ou soit comme traceurs lors de tests ELISA compétitifs pour la mise au point des dosages proprement dits. Cette étude nous a permis de développer complètement une méthode de dosage immunoenzymatique du thirame et d'obtenir des anticorps reconnaissant de manière compétitive les éthylène-bis-dithiocarbamates et un produit issu de leur dégradation, l'éthylènethiourée, reconnue comme cancérogène.To date, the official method to be used for the measurement of dithiocarbamates residues is to first carry out an acid hydrolysis of the samples and, after distillation, to quantify the released carbone disulfure (CS2) by spectrophotometry. But, this procedure is spoilt with many drawbacks, e.g. low reproducibility, detection threshold unsuited for certain quantifications and lack of specificity. On the other hand, the classical quantification techniques, i.e. GC and HPLC, are sensitive and specific, but require a high-cost equipment and qualified operator(s). This is why enzyme immunoassays that, in addition, allow one to process several samples at the same time have sounded as a relevant alternative to the usual techniques. We first report on the synthesis of molecules whose structure is alike that of the pesticides to be quantified. The additional arm they carry, usually, consists of a more or less long chain of methylenes and ends with a carboxylic acid function. These haptens can be linked to the surface of carrier proteins, BSA and Ova, through an amide bond with lysyl residues. Then, in a second step, these various hapten-protein conjugates were used as either immunogens for production of specific antibodies for the pesticides of interest, or tracers in competitive ELISA assays for the development of quantification protocols. This study allowed us to both develop a complete enzyme immunoassay for thirame measurement and get competitive antibodies for ethylene-bis-dithiocarbamates and one of their by-products, ethylenethiourea, known as being carcinogenic.BREST-BU Droit-Sciences-Sports (290192103) / SudocSudocFranceF