Système de biopuce optique en temps réel (application au diagnostic génétique)

Les puces à ADN, ont vu le jour à la fin du vingtième siècle. L'utilisation de l'Imagerie par Résonance des Plasmons de Surface dans de tels outils est très prometteuse. En effet cette technique permet de suivre en temps réel et en parallèle, sans l'usage de marqueur, différentes interactions se déroulant sur une surface métallique. Elle nous a servi pour analyser les interactions ADN/ADN dans le but du diagnostic génétique. Pour cela nous avons fixé des molécules d'ADN biotinylées sur une surface d'or par l'intermédiaire d'une structure auto-assemblée composée successivement un acide thiolé, d'un polymère chargé positivement et de l'ExtrAvidine. L'analyse des interactions ADN/ADN montre que le système employé permet de distinguer la formation d'un double brin d'ADN totalement complémentaires de celle d'un double brin avec une mutation. Cette distinction est nette pour une délétion. Le cas plus subtil d'une substitution nous a poussé à examiner l'effet de la longueur des ADN sur la réponse optique du système. Cette étude a fait ressortir l'influence de la température de fusion des séquences sur le signal obtenu. La représentation des résultats en fonction de ce dernier paramètre a permis de les modéliser, d'expliquer la différence de comportement des diverses molécules utilisées et de prédire le résultat des hybridations entre oligonucléotides quelconques. Ainsi, pour valider notre modèle, nous avons conçu un ensemble de séquences capable de révéler six des plus fréquentes mutations de la mucoviscidose. Les résultats expérimentaux ont coïncidé avec les résultats théoriques. Les premiers essais de diagnostic génétique sont prometteurs.In the second half of the twentieth century, the world witnessed the birth of new technologies such as DNA biochips. The use of Surface Plasmon Resonance Imaging in those techniques is emerging nowadays. It allows following without using any marker, in real time and in parallel, the interactions taking place on a metal surface often made of gold. We exploit this imaging technique to analyze DNA/DNA interactions in order to achieve a genetic diagnosis. Therefore, we fixed single strands of biotinylated DNA on gold surfaces via a self-assembled structure composed successively by a mercaptoundecanoic acid, a positively charged polymer and an ExtrAvidin layer. The results obtained when studying DNA/DNA hybridization, show that the system response depends on the complementarity of DNA strands. As a matter of fact, we could easily determine the presence of a deletion meanwhile the single base mismatch was difficult to detect. To solve this problem we studied the effect of oligonucleotide's length. The results highlighted the importance of DNA's base composition and melting temperature. After representing the sensor's response as a function of DNA's melting temperature calculated under certain conditions of salt concentration, we were able to predict the hybridization signal for any single strand DNA used and to understand why it was difficult to detect the single base mismatch. Based on our prediction method we designed a set of oligonucléotides that allow the detection of six mutations located on the Cystic Fibrosis gene. The results obtained agreed with the calculated value and opened the way for the realization of a DNA chip for genetic diagnosis.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF