Mise au point de nouveaux modèles d'évaluation du stress oxydant sur cellules vivantes adhérentes in vitro (application à la mélatonine et à la tacrine)

Les marqueurs du stress oxydant tels que le glutathion (GSH) et les espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont des marqueurs précoces mais labiles du stress oxydant. Les méthodes d'évaluation classiques de ces marqueurs sont des méthodes biochimiques peu adaptées à l'hétérogénéité cellulaire, qui induisent le plus souvent des artéfacts et aussi l'altération des marqueurs à l'origine entraînant une perte de sensibilité et de spécificité. C'est pour remédier à ces difficultés que nous avons entrepris de mettre au point de nouveaux tests d'évaluation du stress oxydant, directement sur cellules vivantes adhérentes en microplaque. Nos travaux ont été réalisés sur le modèle de la lignée de cellules hépatique humaine Hep G2, qualitativement et quantitativement riche en enzymes de métabolisation avec une bonne stabilité dans le temps. Le GSH a été évalué avec le monochlorobimane (mBCl), les ERO avec la 2',7'- dichlorofluorescéine diacétate (DCFH-DA). Les sondes fluorescentes utilisées, bien connues en cytométrie en flux (CMF), ont été détectées avec un cytofluorimètre en microplaque doté de la technologie d'illumination dite de " lumière froide ", le Fluorolite 1000-DynexTM. L'application de ces tests a révélé que le stress oxydant est l'un des mécanismes d'hépatotoxicité de la tacrine et de cytotoxicité de la mélatonine. Ce stress oxydant se traduit par une production excessive d'ERO associée à une baisse significative du GSH. L'anéthole dithiolethione (ADT) joue un rôle préventif dans l'apparition du stress oxydant induit par la tacrine. De plus, nous avons confirmé l'action antioxydante de la mélatonine à des concentrations faibles et des temps d'incubation courts, et démontré son action prooxydante pour des temps d'incubation plus longs. En outre, nous avons pu mettre en évidence, au niveau cellulaire, l'existence de rythmes circadiens, pour des intervenants métaboliques majeurs comme le GSH et l'activité mitochondriale. Les méthodes que nous avons développées sur cellules vivantes adhérentes sont sensibles, spécifiques, fiables, reproductibles et standardisables. Elles peuvent donc aider à répondre à des questions d'ordre mécanistique ou méthodologique tout au long du développement des médicaments. De plus, elles indiquent que la chronologie est un outil essentiel dans l'amélioration des interprétations des tests de pharmacotoxicologie cellulaire, ouvrant la voie de la " chronopharmaco-toxicologie " cellulaire.@The early oxidative stress markers such as Glutathione (GSH) and Reactive Oxygen Species (ROS) are unstable markers. The usual methods for assessing these markers are biochemical methods which are not adapted to cellular heterogeneity. These methods generally induce artefacts and also the deterioration of the markers that lead to the loss of sensitivity and specificity. In order to solve these problems we undertook to develop new assays for assessing these stress oxidant markers directly on live adherent cells in microplate. The methods which we developed on live adherent cells are sensitive, specific, reliable, reproducible and standardisable. They can thus help to answer questions of mechanistic or methodological nature throughout the development of new drugs. Moreover, they indicate that the chronology is an essential tool in the improvement of the interpretations of the tests in cellular pharmacotoxicology, opening the field of cellular "chronopharmaco-toxicology".PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF