Le transporteur mitochondrial de nucléotides adényliques de la levure S. cerevisiae (contribution de chaque sous-unité à l'organisation membranaire et à la fonction de transport)

Le transporteur mitochondrial de nucléotides adényliques (Ancp) est une protéine de 32 kDa localisée dans la membrane interne. Elle appartient à la famille des transporteurs mitochondriaux. Elle permet l'échange de l'ADP contre de l'ATP entre le cytoplasme et la matrice. L'Ancp possède 6 segments transmembranaires potentiellement organisés en hélices a reliées par des boucles hydrophiles. De nombreuses études ont montré, que, in vivo, l'Ancp se trouve sous forme dimérique. Ce travail a consisté à étudier le rôle de chacune de ces sous-unités dans la fonction de transport et dans la structure de l'unité fonctionnelle. Pour cela, nous avons constrtuit des gènes permettant l'expression de deux types d'hétérodimères en tandem. Dans ces chimères, un des protomères est de type sauvage (Anc2) et l'autre est soit un mutant inactif de ANC2 (op1) soit un autre membre de la famille des transporteurs mitochondriaux : le transporteur de phosphate (PiC). Les constructions ANC2/op1 et PiC/ANC2 ont été respectivement introduites dans une souche delta anc2 et une souche delta pic, delta anc2. Ces gènes restaurent la croissance sur lactate de façon comparable à ANC2 sauvage. De plus, Anc2-Picp et Pic-Anc2p restaurent de façon simultanée l'échange ADP/ATP et le transport du Pi. L'expoession in vivo de ces gènes conduit à des protéines de 64 kDa. Les paramètres cinétiques de l'échange ADP/ATP ainsi que ceux de la liaison d'un inhibiteur spécifique de l'Ancp, l'atractylate, ont été comparés à ceux de Anc2p. Nos résultats expérimentaux indiquent que les monomères coopèrent lors de l'échange des nucléotides. De plus, les propriétés de la chimère de PiC permettent de conclure quant à la structure tertiaire du monomère dans la membrane mitochondriale.The adenine nucleotide carrier (Ancp) is a 32 kDa mitochondrial protein located in the inner membrane. It is a member of the mitochondrial carrier family. Ancp allows the exchange of ADP versus ATP between cytoplasm and matrix. It contains six transmembrane segments organized in alpha helix and connected via hydrophilic loops. Numerous studies have shown the endogenous Ancp to be a dimer in vivo. To study the structural folding and functional properties of each monomer within the diner, we have constructed genes encoding two types of covalent tandem heterodimers. In these chimeras, one of the subunits is of the wild type and the other is either an inactive mutant of ANC2 (op1) or a member of the mitochondrial carrier family, namely the phosphate carrier (PiC). The ANC2/op1 and the PiC/ANC2 contructs were respectively introduced into a delta anc2 and a double deleted delta pic, delta anc2 mutant strains and then the restoration of growth on non-fermentable carbon sources was studied. Results indicate that Anc2-op1p and op1-Anc2p were as efficient as Anc2p. Moreover, Anc2-Picp and Pic-Anc2p were able to simultaneously restore both the ADP/ATP and Pi transport functions. In vivo, expression of the dimeric genes led to synthesis of stable 64 kDa proteins. Binding properties of [3H] ATR, a specific inhibitor of Ancp, and ADP/ATP exchange kinetics were compared with those of Anc2p. Our results indicate that protomers of the op1/Anc2p chimera cross talk to each other during the nucleotide exchange. Furthermore, the properties of PiC chimera have allowed us to conclude about the tertiary structure of the monomer in the mitochondrial inner membrane.BORDEAUX2-BU Santé (330632101) / SudocSudocFranceF