Dissection du mécanisme de terminaison-antiterminaison au niveau du terminateur tR1 du phage lambda (application à l'étude des complexes ARN-protéine in vivo)

Chez Escherichia coli la terminaison de la transcription peut intervenir selon deux mécanismes distincts : tout d'abord la terminaison intrinsèque qui correspond à une séquence ADN, codant pour une structure en tige boucle riche en GC suivie d'une répétition d'uridine sur l'ARN, induisant le relargage de l'ARN polymérase. Le second mécanisme est gouverné par un facteur de terminaison nommé Rho qui gouverne environ 50% des évènements de terminaison chez E. coli. Au cours de ma thèse, je me suis interessé à ce deuxième mécanisme, et plus particulièrement à sa régulation in vivo (antiterminaison). Rho, sous la forme d'un anneau héxamèrique, se fixe à l'ARN naissant au niveau d'un site d'entrée (également appelé RUT), puis utilise son activité ATPase pour longer l'ARN et disssocier le complexe ternaire d'élongation stoppé au niveau d'un site de pause. Les terminateurs Rho-dépendants sont assez mal définis et peu d'entre eux ont été analysés en détail. Le terminateur tR1 du phage lambda (l) est le terminateur Rho-dépendant le plus étudié à la fois in vitro et in vivo. La terminaison Rho-dépendante au niveau de ce terminateur est gouvernée principalement par les séquences localisées en 5', codant deux régions du transcript nommées RUTA et RUTB. Ces deux régions sont séparées par le motif ARN BOXB qui n'est pas indispensable à l'action de Rho mais sert, dans le mécanisme d'antiterminaison, de site de fixation pour la protéine N du phage l. Grâce à un système minimal d'étude in vivo, nous avons montré que le motif BOXB possède une fonction double dans les mécanismes de terminaison/antiterminaison au niveau de ltR1 régulant l'expression temporale du génome du phage l. Sous la forme d'une tige boucle hautement structurée, BOXB agit comme un lien permettant de placer RUTA et RUTB l'un à coté de l'autre pour une interaction optimale avec Rho et une terminaison efficace. A l'inverse, la fixation de la protéine N sur BOXB induit l'antiterminaison au niveau de ltR1 en empèchant l'accès de Rho à l'ARN. Ce double rôle à été démontré in vivo en substituant au couple N/BOXB la "coat protein" du phage MS2 et son motif cible en tige boucle. En complément de ce travail, j'ai utilisé cette faculté d'un complexe ribonucléoprotéique de bloquer la terminaison Rho-dépendante, pour développer une nouvelle approche d'étude, in vivo, des complexes ARN-protéine.ORLEANS-BU Sciences (452342104) / SudocSudocFranceF