Structure et fonction d'une cytokinine oxydase / déshydrogénase (modifications d'enzymes)

L'objet de cette thèse est l'étude d'une cytokinine oxydase/déshydrogénase du maïs (ZmCKO1). La flavoenzyme CKO catalyse la dégradation des hormones végétales de type cytokinines, dérivés N6-substitués de l'adénine. Il s'agissait de déterminer l'importance du rôle de CKO dans le développement des plantes, la structure de l'enzyme et l'acide aminé clef dans la réaction enzymatique, le mécanisme réactionnel en présence de deux types d'inhibiteurs différents, la localisation des sites catalytiques oxydase et déshydrogénase?Afin de mieux comprendre le rôle de la CKO dans l'homéostasie des cytokinines, la teneur en hormone a été modifiée en surexprimant ZmCKO1 de manière constitutive chez Arabidopsis thaliana. Les effets phénotypiques et les teneurs en cytokinines ont été déterminés de même que l'expression de gènes endogènes impliqués dans la biosynthèse, la dégradation et la signalisation des cytokinines. ZmCKO1 a été exprimée dans la levure Yarrowia lipolytica, purifiée et ses propriétés moléulaires et cinétiques caractérisées ; elle a été cristallisée et sa structure obtenue avec une résolution de 1,95 Å en présence de deux types d'inhibiteurs, des analogues d'adénine N6-substituée et de cytokinines de type urée. Des expériences de mutagenèse dirigée confirment le rôle clef de Asp169 dans la catalyse enzymatique et indiquent l'importance d'autres résidus d'acide aminé dans l'interaction avec le substrat et les accepteurs d'électrons. Un mécanisme réactionnel de type ping-pong est proposé, la molécule organique acceptrice d'électrons, tout comme l'oxygène, se liant au site actif en face de l'azote N5 du FAD.The Ph.D. thesis is focused on the study of cytokinin oxidase/dehydrogenase from maize (ZmCKO1). CKO is a flavoenzyme and catalyzes the degradation of plant hormones cytokinins, which are N6-substituted adenine derivatives. Four questions were adressed: (i) how important is the role of CKO in plant development? (ii) what is the structure of the enzyme and what is the key amino acid residue in enzyme reaction? (iii) what is the mechanism of CKO inhibition with two different types of synthetic cytokinin derivatives and whether is the inhibition accompanied by enzyme modification? (iv) are the oxidase and dehydrogenase catalytic sites different?To unravel the role of CKO in cytokinin homeostasis, content of the hormone was altered by constitutive overexpression of ZmCKO1 in Arabidopsis thaliana. Effects on phenotype and changes in levels of cytokinins were determined as well as expression of endogenous genes related to cytokinin biosynthesis, degradation and signaling. ZmCKO1 was further expressed in the yeast Yarrowia lipolytica, purified, and its molecular and kinetic properties were characterized; it was further crystallized and its structure solved up to 1.95 Å resolution in presence of two types of inhibitors - N6-substituted adenine and urea-type cytokinin analogs. Site-directed mutagenesis confirmed the key role of Asp169 in enzyme catalysis and revealed the importance of some other amino acid residues in the interaction with substrate and electron acceptors. This work leads to the proposal that the CKO reaction proceeds through a pingpong mechanism and that organic electron acceptor as well as oxygen bind in the active site in front of nitrogen N5 of FAD.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF