Voies de signalisation impliquées dans la réponse de cellules ostéoblastiques à une contrainte mécanique cyclique.

Les ostéoblastes sont les régulateurs clé du remodelage osseux en réponse à la contrainte mécanique. Cependant les mécanismes moléculaires conduisant à cette réponse restent encore mal connus. -1- Nous avons montré que des contraintes mécaniques cycliques de 1% (CM) (10 min, 0.25Hz) stimulent la prolifération de cellules ostéoblastiques ROS 17/2.8, qui est bloquée par le PD98059, un inhibiteur de MEK. De plus, la phosphorylation du site tyrosine (Y) 187 de la MAPK ERK2 augmente avec le temps après CM. L'immunoprécipitation (IP) par anticorps anti-P-Y suivie d un immunoblot (IB) anti-P-Y a montré que 3 groupes de protéines étaient phosphorylées par la CM et qui pouvaient correspondre à FAK, src et PYK2, toutes 3 localisées au contact focal. L analyse quantitative de cellules immunomarquées par Ac anti P-Y montre une augmentation du nombre et de la taille des contact focaux chez les cellules contraintes suggérant un remodelage de l adhérence intégrinique au cours de ce stimulus mitogène. Utilisant la même approche IP/IB nous avons montré que la CM active FAK aux sites Y 397 et 925. La transfection des cellules avec un vecteur d expression exprimant FAK mutée en Y397 bloque complètement la phosphorylation de ERK2Y187. La CM induit également la phosphorylation du site Y418 de src et l association de src avec FAK. L utilisation d un inhibiteur de la famille src, le pyrazolopyrimidine 2 (PP2) diminue la phosphorylation basale de FAKY397 mais n empêche pas son activation par la CM. La CM active également le résidu Y402 d'une tyrosine kinase PYK2 homologue de FAK, ainsi que son association avec cette dernière. L ajout d'un chélateur du calcium intra ou extracellulaire empêche l activation de PYK2 uniquement à 4h. La mutation de Y402 de PYK2 empêche la phosphorylation de ERK2 uniquement 4h après l'arrêt de la CM. Au total, la mitogénicité de la CM pour des ostéoblastes dépend de ERK2 dont l'activation est sous le contrôle de la phosphorylation de FAK et de PYK2. -2- Nous nous sommes ensuite intéressés à 2 protéines adaptatrices, Paxilline et Hic-5 qui sont phosphorylées par la CM avec la même cinétique que FAK et PYK2. L'immunomarquage montre que ces 4 protéines sont localisées au contact focal chez les contrôles Cependant, leur localisation subcellulaire et leurs associations respectives diffèrent après CM. Alors que FAK et paxilline restent au contact focal, PYK2 et Hic-5 sont transportées au noyau 30 min après la CM commencent à retourner au contact focal à 4h. L'association PYK2/ Hic-5 augmente avec le temps chez les cellules contraintes alors que celle Hic-5/ paxilline diminue. La localisation nucléaire de PYK2 et de Hic-5 a été confirmée par IB des protéines nucléaires. Ces résultats suggèrent que l'association PYK2/Hic-5 observées sous CM se fait au dépens de celle avec Paxilline.ST ETIENNE-BU Médecine (422182102) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF