Voies métaboliques d'époxydations et d'hydroxylation des acides gras poly-insaturés à longue chaîne par les cytochromes P450 humains

Depuis la découverte de la troisième voie catalytique d'oxydation de l'acide arachidonique par les cytochromes P450 (CYP), s'ajoutant à celles des lipoxygénases et des cyclooxygénases, il est apparu que les oxylipides formés (lipides contenant 3 atomes d'oxygène) ont des rôles biochimiques importants. Notre étude a pour but de réexaminer les voies d'époxydation et d'hydroxylation de plusieurs acides gras polyinsaturés à longue chaîne (AGPI-LC) par 17 CYPs humains recombinants. Le métabolisme des acides gras étudiés, 8,11,14-ETA (C20:3 n- 6), 5,8,1 1-ETA (C20:3 n-9), AA (C20:4 n-6), EPA (C20:5 n-3) et DHA (C20:6 n-3), a été analysé par chromatographie en phase liquide ou gazeuse couplée soit à la spectrométrie de masse, soit à un détecteur de radioactivité. Nous montrons que les CYP2C et 2J2 sont des époxygénases de ces AGPI. L'effet du nombre de doubles liaisons et de la longueur de la chaîne sur l'activité et la régiosélectivité dépend de l'isoforme utilisée. Cependant il apparaît clairement que toutes les isoformes de la sous-famille CYP2C possèdent deux sites de fixation. Les autres CYPs des familles 1 à 3 sont également capables d'époxyder les AUPI, soit de façon régiosélective, dans le cas des CYP1A1, 2D6 et 2E1, l'époxydation étant alors limitée aux acides gras des familles 6 et 3, soit de façon moins régiosélective, pour les CYP1A2 et 3A4 capables d époxyder tous les APGI étudiés, Nous montrons en outre que les CYP4F sont les principales hydroxylases des AGPI-LC. La réaction d' -hydroxylation est majoritaire, ce qui implique un positionnement strict du substrat dans le site actif. Pour toutes les isoformes de la famille CYP4, la présence d une double liaison en position 14,15 et 17,18 ou l absence de la double liaison en position 5,6 dans les AG C20 5,6 diminue l efficacité de la réaction pour la formation du dérivé -hydroxylé. Ceci entraîne alors une régiosélectivité plus faible pour l EPA avec un rapport / -1 diminué. De même, le DRA, de la famille 3 comme I EPA, présente également un rapport / -1 plus faible que celui obtenu avec les AG des familles 6 et 9. Toutefois, les CYPs des familles 1 à 3, connus pour métaboliser les médicaments, ont également la capacité d hydroxyler les AGPI-LC, de préférence en position -1, à l exception des CYP1A2 et 3A4 qui hydroxylent les positions bis-allyliques. Nos résultats sont discutés à la lumière des facteurs thermodynamiques et stériques susceptibles d influencer le positionnement du substrat dans le site actif de l enzyme.Since the discovery of the third catalytic oxidative pathway of arachidonic acid by cytochromes P450, adding to those of lipoxygenases and cyclooxygenases, it appeared that these oxylipids (i.e. lipids containing 3 atoms of oxygen) have important biochemical and biological roles. The goal of this study was to reconsider the epoxidation and hydroxylation of long chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) by 17 human recombinant cytochromes P450 (CYP). The fatty acids studied, 8,11,14-ETA (C20:3 n-6), 5,8,1 1-ETA (C20:3 n-9), AA (C20:4 n-6), EPA (C20:5 n-3) and DHA (C20:6 n-3), were analysed by gas or liquid chromatography coupled to mass spectrometry or to a radioactivity detector. We show that CYP2C and 2J2 are the main epoxigenases of these PUFAs. The effect of the number of double bounds and the length of the chain on the activity and the regioselectivity of the reactions depends on the CYP isoform. However, it appears clearly that all CYP2C subfamily members have two binding sites. The others CYPs from families 1 to 3 are also able to epoxidize PUFAs, either by a regioselective pathway, with CYP1A1, 2D6 and 2E1, the epoxydation then being limited to the fatty acids from the 6 and 3 families, or by a less regioselective pathway, with CYP1A2 and 3A4, which are able to epoxidize all the studied PUFAs. We also demonstrate that CYP4F are the main hydroxylases of the LC-PUFAs. The -hydroxylated compounds are the major products, implicating a strict positionning of the substrate in the active site. For all CYP4 famiiy isoforms, the presence of a double bound in position 14,15 and 17,18 or the absence ofthe 5,6 double bond in the PUFA C20 5,6 decrease the efficiency of formation of the -derivatives. This results in a weaker regioselectivity for EPA with a decreased /( -1) ratio. Similarly, DHA, which belongs to the co3 family, like EPA, shows a smaller /( -1) ratio than fatty acids from the 6 and 9 families. Nevertheless, CYPs from families 1 to 3, known to metabolise drugs, can also hydroxylate LC-PUFAs, preferentially at the ( -1) position, with the exception of CYP1A2 and CYP3A4 that hydroxylate on te bis-allylic positions. Our results are discussed in light of thermodynamic and steric factors that may influence the positioning of the substrate in the enzyme active site.BREST-BU Droit-Sciences-Sports (290192103) / SudocSudocFranceF