Étude structurale de la protéine SelB, impliquée dans l incorporation des sélénocystéines lors de la synthèse protéique bactérienne.

La sélénocystéine est aujourd hui connue comme le 21ème acide aminé incorporé dans les protéines lors de leur synthèse par le ribosome. Chez les bactéries, cette insertion co-traductionnelle s effectue en réponse à un codon opal (UGA) immédiatement suivi d une structure en tige-boucle spécifique appelée SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) sur l ARN messager. La protéine SelB est un facteur d élongation spécialisé, homologue à EF-Tu et dont le rôle est d apporter un ARN de transfert spécifique chargé avec de la sélénocystéine (SecARNtSec) au site A du ribosome via la reconnaissance de SECIS. Comparativement à EF-Tu, SelB possède une extension C-terminale composée de quatre domaines structuraux de type winged-helix (WH1 à WH4), responsable de la reconnaissance spécifique de la tige-boucle. Sont présentées dans cette thèse deux structures cristallographiques de ce fragment complexé à la tige-boucle SECIS. La première chez E.coli correspond aux domainesWH3-WH4. La structure montre comment ces deux domaines en tandem agissent en synergie pour reconnaître spécifiquement des nucléotides exposés dans l ARN : G23 sur la boucle apicale et U17 exclu de l hélice. L interprétation des nombreuses données génétiques et biochimiques disponibles antérieurement est discutée ici. La deuxième structure correspond aux domaines WH1-WH4 chez M.thermoacetica. Comparé à la forme libre dont la structure avait déjà été résolue, le fragment protéique en complexe avec SECIS subit un changement de conformation au niveau d une région centrale charnière conduisant à un large basculement entre les tandems WH1-2 et WH3-4. La présence d une molécule d ARN SECIS supplémentaire au niveau de cette région charnière pourrait mimer une interaction entre SelB et l ARN ribosomique ou l ARN de transfert. Une dernière partie expose un projet initié en collaboration avec l Institut d Optique de Palaiseau, portant sur l étude du ribosome bactérien par spectroscopie de fluorescence en molécule unique.Selenocysteine is known as the 21st aminoacid incorporated into proteins during their synthesis. In bacteria, this cotranslational insertion is accomplished in response to an opal (UGA) codon, immediatly followed by a stem-loop structure in the mRNA called SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence). SelB is a specialised elongation factor, homologous to EF-Tu, able to interact with SECIS in order to bring a specific tRNA charged with selenocysteine (Sec-tRNASec) in the ribosomal A site. Compared with EF-Tu, SelB exhibit a C-terminal extension composed of four winged-helix domains (WH1 to WH4) carrying the mRNA binding function. This work presents two new crystallographic structures of the C-ter fragment complexed with the SECIS stem-loop. The first one, in E.coli, corresponds to domains WH3-WH4. The structure shows how these two domains arranged in tandem can act in a synergic way to recognize two extruded bases : G23 and U17 in the stem-loop. These observations explain the great amount of genetic and biochemical data already known. The second structure corresponds to domains WH1 to WH4 in M.thermoacetica. Here we compare the structure of the entire fragment in its RNA bound form with the already known structures of the free form and a shorter fragment (WH3-WH4) complexed to SECIS from M.thermoacetica. We observed a large domain rearrangement upon RNA binding between tandems WH1-2 and WH3-4. The presence of a neighbouring SECIS RNA molecule at the hinge region between the two may mimic some interactions with ribosomal or transfert RNA. Finally, results obtained in collaboration with the Institut d Optique in Palaiseau are presented. The goal is to study the bacterial ribosome by single-molecule fluorescence spectroscopy.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF