Méthode computationnelle pour la prédiction de la mobilité des peptides et l'identification de leurs sites de phosphorylation par empreinte phospho-peptidique bidimensionnelle sur couche mince de cellulose

Actuellement, un des plus importants challenges en biologie est la compréhension des mécanismes moléculaires modulant et régulant les fonctions cellulaires, et plus particulièrement le rôle des modifications post-traductionnelles des protéines. Contrairement au génome, qui est le même pour chacun des cellules d'un organisme, les protéomes varient dynamiquement en fonction du type cellulaire, de la physiologie cellulaire et au travers de modifications post-traductionnelles intervenant sur plusieurs sites simultanément. Pour les protéines eucaryotes, la phosphorylation réversible est parmi les plus importantes modifications et agit en modulant de nombreux évènements cellulaires incluant la progression du cycle cellulaire, la croissance et la différentiation. Approximativement 30% des protéines cellulaires sont susceptibles d'être phosphorylées et environ 30% de ces protéines sont phosphorylées à tout moment. Bien que le marquage métabolique avec [32P] permette d'accroître le seuil de détection des phospho-protéines, ce dernier n'est pas compatible avec la spectrométrie de masse. Nous avons donc développé une méthode alternative pour l'identification des protéines et de leurs modifications post-traductionnelles à partir de la séparation de peptides trypsiques en deux dimensions sur couche mince de cellulose. Les peptides sont, dans un premier temps, séparés par électrophorèse à haut voltage en fonction de leurs charges nettes et de leurs masses moléculaires avant d'être séparés en deuxième dimension en fonction de leurs propriétés physico-chimiques par chromatographie ascendante. La mobilité est mesurée pour chacun des peptides dans les deux dimensions en co-migrant des peptides marqueurs pour calibrer la migration, et leur identification est établie à partir de leurs scores d'identité dérivés des modèles calculant les mobilités électrophorétiques et chromatographiques théoriques à partir de la séquence primaire des peptides. Le taux de réussite de notre approche est estimé à 98% pour un mélange peptidique simple et à 80% sur l'ensemble des digestions protéiques. De plus, nous sommes capable d'identifier spécifiquement une même séquence peptidique contenant des sites phosphorylés, oxydés et/ou d'exception pour la trypsineTo date, one of the most important challenges in biology is to understand the molecular mechanisms which modulate and regulate cellular functions and in particular the role of protein post-translational modification. Contrary to the genome with is the same for each cell within an organism, proteomes vary dynamically according to cell type, cell physiology and through multi-site simultaneous post-translational modifications. In eukaryotic proteins, reversible phosphorylation is among the most important modifications and acts in modulating many cellular events including cell cycle transit, growth and differentiation. Approximately 30% of cellular proteins are susceptible to phosphorylation and around 30% of these proteins are phosphorylated at any given time. While metabolic labelling with [32P] provides a powerful and highly sensitive means to increase phospho-protein detection threshold, it is presently incompatible with mass spectrometry. We have therefore developed an alternative method for identifying proteins and post-translational modifications based on analysis of two dimensional tryptic peptide separation on thin layer cellulose plates. Peptides are separated by high voltage electrophoresis according to net charge and molecular mass before second dimension separation by physical-chemical characteristics in a water solvent exchange system using ascending chromatography. Phospho-peptide mobility is measured for each peptide in each dimension with the use of co-migrated marker peptides to calibrate peptide migrations and peptide identity established from an identity score derived from models calculating the predicted electrophoretic and chromatographic mobilities from the primary aminoacid sequence of the peptides. The success rate of this approach, which exceeds 98% on simple peptide mixtures, is estimated at 80% on whole protein digests. Moreover, we are able to specifically differentiate a same peptidic sequence containing phosphorylated, oxidized amino acids and/or exception trypsic sitesMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF