Caractérisation biochimique de protéines de la famille Pentatricopeptide repeat chez Arabidopsis thaliana et le colza

Les protéines PPR (PentatricoPeptide Repeat), particulièrement nombreuses chez les plantes supérieures, se révèlent être des acteurs majeurs de l expression des gènes des chloroplastes et des mitochondries. Leur fonctionnement à l échelle moléculaire est encore inconnu ; il est cependant proposé qu elles puissent servir d adaptateurs moléculaires pour recruter des activités enzymatiques spécifiques sur des cibles ARN précises. Afin de tester la validité de cette hypothèse, l objet de ce travail de thèse a consisté à rechercher les partenaires protéiques et les cibles ARN de certaines protéines PPR d Arabidopsis à l aide d approches biochimiques. La fonction de la protéine restauratrice PPRB, codée au locus Rfo, a également été étudiée chez le colza, afin de mieux comprendre son incidence sur l expression du gène mitochondrial orf138 inducteur de la stérilité mâle cytoplasmique Ogura et contribuer à l élucidation du mécanisme de restauration de la fertilité. Nous avons tout d abord produit des transformants stables d Arabidopsis permettant de détecter 9 protéines PPR différentes grâce à leur fusion à de courts épitopes peptidiques. Ce matériel a permis de révéler la présence de quatre d entre elles dans des complexes multiprotéiques in vivo. Le faible rendement du protocole de double purification choisi pour l isolement ultérieur des complexes protéiques a limité l identification de partenaires protéiques. Les cibles ARN, ont été recherchées à l aide de la méthode du RIP-Chip. Cette analyse révèle pour la protéine PPR336, une capacité à lier de nombreux ARN mitochondriaux, avançant ainsi une nouvelle fonction pour une protéine PPR. Enfin, nous avons pu montrer que parmi les différentes protéines PPR fortement similaires également codées au locus Rfo, et accumulées dans les anthères de jeunes boutons floraux, seule la protéine PPRB induit la disparition de l ORF138 de façon quasi-totale et homogène. Nous avons révélé la corrélation de l activité de restauration de PPRB avec sa capacité à lier le transcrit orf138, dont l accumulation et la maturation ne sont pas affectées, en ciblant très probablement sa région 5 UTR. Nous proposons donc que cette liaison soit à l origine d un blocage de l initiation de la traduction du transcrit orf138 empêchant ainsi la synthèse de la protéine responsable de la SMC-Ogura.PentatricoPeptide Repeats proteins, whose family has literally exploded in higher plants, are key factors of mitochondria and chloroplast gene expression. Their molecular functions remain to be elucidated. The PPR proteins are proposed to constitute molecular adaptors that could recruit catalytic proteins to a specific site on RNA targets. In order to test the validity of this assumption, the aim of this work was to try to determine their protein partners and their RNA targets with biochemical approaches. The role of the restorer protein, PPRB, encoded at the Rfo locus, was also studied in rapeseed in order to gain insight into its role during the expression of the orf138 mitochondrial gene which induces Ogura male sterility. First, Arabidopsis stable transformants expressing nine PPR proteins fused to small tags were produced. Analysis of stromal and mitochondrial extracts by size exclusion chromatography allowed us to observe that 4 of the detected PPR proteins were involved in large multi-protein complexes. We used a tandem affinity purification strategy in order to identify their putative partners but its poor yield, limited the identification of partners. We used a RIP-Chip strategy for the characterization of PPR proteins RNA targets. This strategy revealed that PPR336 was able to bind a lot of RNA targets, thus suggesting a new function for PPR proteins. Finally we showed that the PPRB protein accumulates in young buds anthers, like other PPR proteins encoded at the Rfo locus. However, it was the only PPR protein to induce the disappearance of ORF138 protein in these tissues. We revealed the correlation of restoration activity with an ability to bind the orf138 transcript, whose accumulation and maturation are unchanged in restored plants, probably by binding the 5 UTR region of the mRNA. We proposed that the binding could impair the translation initiation and inhibit ORF138 protein synthesis.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF