Nucléoside diphosphate kinases (repliement et stabilité)

Les Nucléoside Diphosphate kinases (NDPK) sont des enzymes responsables de la synthèse des nucléosides triphosphates. Hexamériques chez les eucaryotes, leur structure stabilise les monomères. Chez l'homme, l'isoforme A est codé par le gène Nm23 lequel est également un gène suppresseur de métastases. La mutation naturelle S120G déstabilise les monomères qui perdent leur capacité à se renaturer correctement et restent in vitro sous forme d'intermédiaires de repliement de type molten-globule. (1) Nous avons montré que l'ATP corrige le défaut de repliement du mutant S120G en phosphorylant son histidine catalytique. Ce mécanisme physiologiquement pertinent explique pourquoi la protéine mutée est fonctionnelle dans les cellules cancéreuses. Le chaperon chimique triméthylamine-N-oxyde corrige également le défaut de repliement du mutant S120G, mais par un mécanisme différent de celui de la phosphorylation. Ces deux mécanismes ont un effet additif. Enfin, l'introduction d'une deuxième mutation "suppresseur intra-génique" corrige partiellement le défaut de repliement. (2) Nous avons également montré que le mutant S120G peut adopter une conformation alternative aberrante et former des fibres amyloides en feuillets b. Plusieurs modèles corrèlent la stabilité des enzymes oligomériques à l'aire d'interface enfouie. Plus l'interface est grande, plus le complexe est thermostable. La NDPK de M. tuberculosis est hexamérique et présente une interface de 30 % plus faible que celle d'autres NDPK (celle de D. discoideum par exemple) pour une stabilité thermique plus élevée. (3) La stabilité de cette NDPK a été étudiée pour comprendre ce paradoxe au niveau structural.Nucleoside Diphosphate kinases (NDPK) are enzymes responsible of nucleoside triphosphate synthesis. Hexameric in eukaryotes, their quaternary structure stabilises monomers. The human isoforme A is encoded by the Nm23 gene which is also known to be a metastasis suppressor. The S120G natural mutation destabilises monomers which become unable to refold correctly and stay in vitro under a molten-globule like intermediate conformation. (1) We have shown that ATP corrects the S120G mutant folding defect by phosphorylating its catalytic histidine. The refolding mechanism by phosphorylation is pertinent physiologically and explains why the mutated protein is functional in tumoral cells. The presence of the chemical chaperone trimethylamine-N-oxyde corrects the folding defect of the S120G mutant but by a mechanism different of that of phosphorylation. Both mechanisms have an additive effect. Introduction of a second site suppressor mutation partially corrects the S120G mutant folding defect. (2) Moreover, we have shown that the S120G mutant can adopt an alternative aberrant conformation and form amyloid fibres rich in b sheets. Several models correlate the stability of oligomeric enzymes to the interface area. Larger is the interface, more thermostable is the complex. The M. tuberculosis NDPK is hexameric and presents 30 % less of interface, as compared to the others NDPK (such as Dictyostelium discoideum, for example) the thermostability of which is higher. (3) We have studied the NDPK stability in order to understand such a paradox at the structural level.BORDEAUX2-BU Santé (330632101) / SudocSudocFranceF