Caractérisation par spectrométrie de masse de réponses précoces du phosphoprotéome d Arabidopsis thaliana au stress en fer

Chez les plantes soumises à un excès de fer, l'induction des ferritines constitue la réponse moléculaire la mieux caractérisée. Ce processus est contrôlé par des étapes de (dé)phosphorylation de protéines. L'objectif de ce travail était de caractériser les variations du phosphoprotéome de cellules d'Arabidopsis cultivées dans différentes conditions de nutrition en fer pour révéler les acteurs moléculaires impliqués dans ces évènements précoces. L'essentiel de l'approche a été réalisé directement à partir des peptides. La stratégie générale a consisté à d'abord optimiser, sur des mélanges de protéines modèles de complexité croissante, des procédures de purification et de tri des peptides phosphorylés, puis à appliquer ces démarches aux situations biologiques d'intérêt. Dans chaque cas, l'identification des sites de phosphorylation a été réalisée par MS/MS, de type MALDI-TOF/TOF ou nanoLC-ESI. Parmi les méthodes développées, la combinaison d'un enrichissement initial par interaction avec du TiO2, d'un fractionnement par échange d'anion et d'une purification finale sur dioxyde de titane, s'est avérée la plus performante pour les mélanges complexes de phosphopeptides. Cette méthode a ensuite été appliquée aux peptides excisés de la face cytoplasmique de la membrane plasmique. Elle a permis d'identifier des sites pS et pT sur des peptides mono- et multi-phosphorylés de diverses protéines membranaires d'Arabidopsis. Parmi les phosphoprotéines identifiées, une partie majeure correspond à des transporteurs ou à des kinases, et un tiers des sites de phosphorylation n'avaient jamais été décrits. Diverses approches de marquage (métabolique, chimique, protéolytique) ont ensuite été adaptées pour quantifier les variations cinétiques de ces sites au cours de la réponse au stress. L'estimation des changements de niveaux de phosphorylation a été réalisé en spectrométrie de masse après fractionnement et enrichissement des peptides comme décrit ci-dessusIn plants facing iron stress, the rapid induction of ferritins constitutes the best characterized molecular response. This process is under the control of phosphorylation/dephosphorylation events. This work aimed at characterizing the changes in the Arabidopsis phosphoproteome according to the iron environment in order to identify molecular events involved in these early steps. The approach was essentially performed directly at the peptide level. The general strategy was to optimize first the purification and fractionation of phosphopeptides from mixtures of model proteins showing an increasing complexity and then to apply the procedures to the biological samples of interest. The identification of phosphorylation sites was performed by MS/MS, either MALDI-TOF-TOF or nanoLC-ESI. Out of the methods elaborated, the combination of an initial enrichment by interaction with TiO2, of peptide fractionation by anion exchange and final purification using titanium dioxide, was proven to be the most effective for complex mixtures of phosphopeptides. This method was then used for peptides from the cytoplasmic side of the plasma membrane. It allowed the identification of pS and pT sites on mono- and multi-phosphorylated peptides from various membrane proteins of Arabidopsis. Among identified phosphoproteins, a main part corresponded to membrane transporters or kinases and one third of phosphorylation sites were not described to date. Different labelling approaches (metabolic, chemical, proteolytic) were then adapted to quantify the temporal pattern of these sites during the response to iron stress. The determination of changes in the phosphorylation levels was made by mass spectrometry after purification and fractionation of peptides as aboveMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF