Groupes microbiens fonctionnels impliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol (diversité, fonction et influence de la température)

Afin de mieux comprendre le fonctionnement des communautés microbiennes intervenant lors de la méthanisation de la cellulose et du méthanol, des échantillons issus de la digestion anaérobie de déchets ont été incubés en présence de cellulose, de glucose, d'acétate et de méthanol enrichis en carbone 13, en conditions mésophiles et thermophiles. Après extraction et séparation de l'ADN lourd et léger par ultracentrifugation sur des gradients de densité (technique SIP), la diversité fonctionnelle a été caractérisée par inventaire moléculaire et analyse phylogénétique. Au total, 20 banques de clones contenant des gènes d'ADNr 16S bactériens (1251 séquences) et 19 banques de clones contenant des gènes ADNr 16S archéens (1312 séquences) ont été obtenues en conditions mésophiles et thermophiles. Des oligonucléotides spécifiques ont ensuite été élaborés et hybridés selon la technique d'hybridation fluorescente in situ afin de confirmer la présence des groupes fonctionnels pré-identifiés. Nous nous sommes ensuite attachés à étudier la relation entre la cinétique de dégradation, les voies métaboliques activées et les groupes fonctionnels impliqués, en suivant la dynamique des diversités fonctionnelles à l'aide de la technique du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP). En appliquant de manière combinée ces techniques sur une série de substrats fonctionnellement connectés, nous dévoilons des réseaux de microorganismes non cultivables impliqués dans la méthanisation de la cellulose et du méthanol. La température d'incubation influence la diversité générale tandis que l'ajout de substrats joue un rôle important sur la diversité fonctionnelle. Les microorganismes appartenant au genre Acetivibrio et à l'ordre Halanaerobiales sont, respectivement, les principaux groupes hydrolysant la cellulose en conditions mésophiles et thermophiles. Les microorganismes appartenant à la famille Porphyromonadaceae et au genre Clostridium sont les principaux fermenteurs du glucose. Par ailleurs, de nombreux microorganismes appartenant à la classe Clostridia, mais éloignés de toutes les souches cultivables répertoriées, ont été identifiés comme des groupes fonctionnels dans toutes les incubations. L'oxydation syntrophique de l'acétate est un processus important dans cet écosystème, qui pourrait être effectué par des microorganismes proches du genre Pseudomonas en conditions mésophiles. Une grande versatilité fonctionnelle a été mise en évidence pour les microorganismes thermophiles et pourrait contribuer à expliquer une dégradation de la cellulose plus rapide et efficace par rapport à celle observée en conditions mésophiles. Enfin, une nouvelle technique, baptisée "SIMSISH" (Secondary Ion Mass Spectrometry In Situ Hybridization), a été développée dans le cadre du travail. Elle permet de visualiser simultanément l'identité microbienne et de mesurer l'enrichissement isotopique à l'échelle d'une cellule. Couplée aux méthodologies SIP, cette technique devrait permettre des progrès décisifs pour l'étude in situ de la contribution des populations microbiennes non cultivables au fonctionnement des écosystèmes complexes.In order to better understand functional communities of microbes catalyzing methanization of cellulose and methanol, samples from municipal solid waste anaerobic digester were incubated with 13C-cellulose, 13C-glucose, 13C-acetate and 13C-methanol under mesophilic and thermophilic conditions. Firstly, the functional diversity was characterized by coupling DNA stable isotope probing (SIP) to phylogenetic analysis. Totally 20 bacterial clone libraries (1251 sequences) and 19 archaeal clone libraries (1312 sequences) of 16S rRNA gene were obtained for both mesophilic and thermophilic conditions. Then, specific FISH probes were designed and hybridized to confirm the presence in situ of pre-identified functional groups. Secondly, we studied the relationships between degradation kinetics, metabolic pathways and microbial functional diversity dynamics, using time-course DNA-SIP coupled to PCR-single strand conformation polymorphism. Thanks to the combination of these techniques on a series of functionally connected substrates, we shed light on the networks of uncultured microbes catalyzing the methanization of cellulose and methanol. Incubation temperature shaped the general microbial diversity while the added substrates played an important role on the functional diversity. Microorganisms affiliated with the genus Acetivibrio and the order Halanaerobiales were respectively the principal cellulose hydrolyzers under mesophilic and thermophilic conditions, whereas microorganisms affiliated with the family Porphyromonadaceae and the genus Clostridium were the main glucose fermenters. Besides, large amount of microorganisms affiliated with class Clostridia, but distantly related to any hitherto cultured strain, were identified as functional groups in all degradation experiments. Syntrophic oxidation of acetate was an important process in this ecosystem both under mesophilic and thermophilic conditions. Interestingly, our results suggest that Pseudomonas-related microorganisms were involved in this process under mesophilic conditions. A high functional versatility of microbial groups was evidenced under thermophilic conditions which could contribute to a more rapid and efficient cellulose degradation compared to mesophilic conditions. Finally, a new technique called SIMSISH was developed during this work providing the possibility to simultaneously visualize the microbial identity and measure the isotopic enrichment at the single cell level. Combined to SIP analysis, this technique might allow a decisive step forward for the study of the function of uncultured microbes within their environments.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF