Etude de la dégradation d'endocan par les neutrophiles et implication dans le sepsis

Le sepsis est une réaction inflammatoire aigüe de l'hôte en réponse à une infection (bactérie, virus, champignon ou parasite) aboutissant très souvent à des dysfonctionnements d'un ou plusieurs organes. Parmi les plus fréquents, on retrouve les troubles respiratoires avec l'ALI (acute lung injury) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA). Le sepsis reste de nos jours un problème dévastateur chez les patients gravement malades puisque malgré les traitements modernes, les taux de mortalité restent élevés, même dans les pays industrialisés. Les neutrophiles sont les premières cellules circulantes recrutées au niveau des sites d'infection. Ils disposent, en effet, de tout un arsenal pour lutter contre les pathogènes envahissant l'organisme : la phagocytose, les espèces réactives de l'oxygène, et des sérine protéases (l'élastase, la cathepsine G et la protéinase 3). Bien que jouant un rôle protecteur dans la défense de l'hôte, les neutrophiles et leurs sérine protéases sont paradoxalement impliqués dans les lésions tissulaires au cours de certaines pathologies inflammatoires tels que le sepsis, le SDRA et l'ALI. Il a d'ailleurs été montré que les neutrophiles sont les principales cellules immunitaires infiltrant les poumons au cours de l'ALI et du SDRA. Le passage des neutrophiles vers les poumons fait intervenir les intégrines leucocytaires CD11/CD18. C'est l'interaction de ces intégrines avec la molécule d'adhérence ICAM-1 des cellules endothéliales qui va initier la migration des neutrophiles à travers l'endothélium vasculaire. L'endothélium est un élément clé dans la régulation de la réaction inflammatoire puisqu'il constitue la barrière entre le torrent circulatoire et les tissus. Lors de pathologies septiques, l'endothélium est dans un état d'activation anormal et prolongé qui aboutit à une inflammation systémique. Les médiateurs pro-inflammatoires, tel que le TNF-a, vont activer la cellule endothéliale et induire l'expression de nombreux gènes, y compris les molécules d'adhérence E-sélectine, ICAM-1 et VCAM-1, qui permettent l'infiltration leucocytaire au cours de sepsis. Endocan est un protéoglycane spécifique de la cellule endothéliale dont l'expression est régulée positivement par les cytokines pro-inflammatoires du sepsis (TNF-a et IL-1) et par le lipopolysacharide (LPS) constituant la paroi des bactéries à gram négatif. Endocan est un protéoglycane de 50 kDa de type dermatane sulfate dont l'expression est préférentiellement pulmonaire et rénale. Endocan est une molécule circulante détecté dans le sang. Chez des patients atteints de sepsis, les taux sériques d'endocan sont augmentés et corrèlent au mauvais pronostic de la maladie. II a été montré in vitro qu'endocan est capable de se fixer aux leucocytes via l'intégrine CD11a/CD18 (LFA-1) et inhibe ainsi l'interaction LFA-1/ICAM-1. Le rôle central des neutrophiles et de l'endothélium au cours du sepsis, et les données connues sur endocan nous ont amené a étudié le rôle d'endocan dans la pathogenèse du sepsis et tout particulièrement l'interaction qui pouvait exister entre endocan et les neutrophiles. Les travaux de thèse ont permis de mettre en évidence que des neutrophiles activés sécrètent des sérines protéases impliquées dans la dégradation protéolytique d'endocan. Nous avons identifié l'élastase comme responsable du clivage séquentiel d'endocan en fragments peptidiques de 15, 12 et 10 kDa, et la cathepsine G comme responsable du clivage d'endocan en un fragment unique de 14 kDa, nommé p14. Par immunoprécipitation, nous avons mis en évidence la co-existence d'endocan et de p14 in vivo, dans le sérum de patients atteints de sepsis ou de sepsis sévère. Les analyses par spectrométrie de masse dévoilent que p14 est un fragment protéique d'endocan dont l'extrémité N-terminale est intacte. Trois sites potentiels de clivage en C-terminal ont été identifiés, et aboutissent à un p14 qui conserve la région riche en cystéine d'endocan. La présence des 18 cystéines, qui sont impliquées dans la formation de ponts disulfures, peut expliquer la résistance de p14 aux activités protéasiques. Nous avons montré que la fixation d'endocan aux leucocytes via l'intégrine LFA-1 est médiée par la chaîne protéique et non glycanique d'endocan, et que cette fixation peut être levée par p14. Grâce à un modèle in vitro en transwell, nous avons montré qu'endocan est capable d'inhiber la migration transendothéliale, LFA-1 dépendante, de leucocytes. Cette inhibition n'est pas observée avec le mutant d'endocan dépourvu de son glycane. L'ensemble de nos résultats suggèrent qu'au cours du sepsis, endocan est clivé en p14 par la cathepsine G sécrétée par les neutrophiles activés. En se fixant au LFA-1, p14 empêche la fixation d'endocan aux leucocytes et empêche ainsi endocan de moduler le recrutement leucocytaire. Tout comme endocan humain, endocan murin est détecté dans le sérum et est clivé par la cathepsine G neutrophile murine en un fragment de 14 kDa. Grâce à un modèle de choc endotoxinique chez la souris 129Sv, nous avons mis en évidence une corrélation entre les taux sériques d'endocan murin et l'évolution du choc endotoxinique qui est surveillé grâce au calcul d'un score clinique de gravité. En effet, lorsque le score clinique de gravité est à son maximum à T24h, les taux d'endocan chutent. Lorsque l'état clinique de la souris s'améliore à partir de T5j, on observe une augmentation du taux d'endocan qui retrouve sa valeur de base à T7j. L'ensemble de nos résultats laissent penser que les interactions endocan-cathepsine G peuvent participer, au cours du sepsis, à la réaction inflammatoire de l'hôte et conduire aux troubles respiratoires lors de l'ALI ou du SDRA. Le fragment de dégradation d'endocan p14, pourrait être envisagé comme une signature moléculaire de l'activité cathepsine G et pourrait potentiellement être un marqueur d'évaluation de l'activation des neutrophiles au cours du sepsisLILLE2-BU Santé-Recherche (593502101) / SudocSudocFranceF