Caractérisation structurale et fonctionnelle de pb2, protéine de la queue du bactériophage T5

Le mécanisme de transport du génome des phages à travers l enveloppe des bactéries est un processus complexe pour lequel les phages ont développé différentes stratégies. Cette thèse étudie le rôle de pb2, la protéine de l extrémité de la queue du bactériophage T5, dans le transport de son génome à travers l enveloppe d E. coli. Les analyses bioinformatiques couplées à des données structurales ont permet d assigner pb2 aux protéines verniers qui déterminent la taille de la queue. Pb2 possède en plus deux segments transmembranaires putatifs dans sa partie C-terminale. Afin de comprendre le rôle de cette région C-terminale dans l activité physiologique de la protéine pb2, j ai surexprimé, purifié et caractérisé pb2-Cterm, correspondant à cette région. Une étude par filtration sur gel, ultracentrifugation analytique et migration sur gel d électrophorèse en conditions natives montre que cette protéine adopte une organisation oligométrique. Des observations en microscopie électronique par coloration négative montrent que pb2-Cterm s organise principalement en pentamètres ou hexamètres, comme cela est suggéré in vivo. La protéine provoque la fusion de LUV (Large Unilamellar Liposomes) et l agrégation de liposomes géants ainsi que des phénomènes d agrégation et de déformation de l enveloppe d d E. coli, observés au microscope optique ou électronique. Enfin, j ai montré que pb*- Cterm est capable d hydrolyser partiellement le peptidoglycane. La protéine pb2 pourrait ainsi former un pore par lequel serait transporté l ADN viral, grâce à ses activités fusogène d hydrolyse du peptidoglycane et déterminer la longueur de la queue du bactériophage T5. Ces caractéristiques uniques.Phage genome transfer through the envelope of the bacterial host is a complex process that is operated via varied mechanisms depending on the phages considered. This work was aimed at clarifying the role of pb2, the tail tip protein of phage T5, during its genome transport through the E. coli envelope. First a bionformatical analysis of pb2 outlined the peculiar organization of this protein compared to other structural proteins of phage and allowed us to assign this protein as a tape measure protein, that determines the length of the tail. To understand the role of the C-terminal domain in the activity of pb2, a shorter 21kDa protein constituting the C terminal end of pb2-Cterm, has been over-expressed and purified. Gel infiltration, analytical ultracentrifugation, and blue native gel analysis demonstrated that this protein has an oligometric organization, ranging from dimers to hexamers, depending on the protein concentration, the pH and salt concentration of the buffer. The size of the particles observed by electron microscopy indicates that the pentametric organization is prevalent, as also suggested in vivo. Pb2-Cterm is able to fuse LUVs (Large Unilamellar Vesicles) and aggregate GUVs. In vivo, it promotes septum deformation of bacteria. Pb2 is also able to partially digest peptidoglycan. Altogether these results suggest that pb2 is a multifunctional protein that has no equivalent in other phages. We propose that this protein forms a DNA pore, thanks to its fusogenic and peptidoglycan hydrolytic activities and also plays a central role during the morphogenesis of the phage by determining the length of the tail.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF