Génération de souris par inactivation fonctionnelle des gènes SIRT (Etude de la fonction du gène Rb dans la différenciation apipocytaire et le métabolisme énergétique)

Chez les mammifères, les protéines SIRT, appelées aussi sirtuines, appartiennent à la famille des histones désacétylases (HDAC) de classe III et ont été nommées ainsi pour leur homologie avec le gène de la levure Saccharomyces cerevisiae Sir2. Il est clairement établi que le gène Sir2 joue un rôle primordial dans l extension de la durée de vie de la levure induite par la restriction calorique et que des copies supplémentaires de ce gène retardent le vieillissement chez la levure. Contrairement aux HDAC de classe I et II, les protéines SIRT nécessitent un cofacteur, le NAD+, pour désacetyler les histones ainsi que d importants facteurs régulateurs de la transcription. Le chef de file des sirtuines, SIRT1, semble impliqué dans des pathologies variées telles le diabète, l obésité, l insuffisance cardiaque, le SIDA et les maladies neurodégénératives. Même si le rôle de SIRT1 n a pas encore été clairement établi in vivo, il apparaît indissociable de la régulation de différents processus biologiques allant de l apoptose à la différentiation adipocytaire et musculaire ainsi que dans le métabolisme glucidique en régulant la néoglucogenèse. La fonction des autres SIRT n est pas encore élucidée.Le sujet de ma thèse de doctorat est d essayer de comprendre les fonctions biologiques des gènes SIRT en les inactivant de façon spatio-temporelle par l utilisation de la stratégie du knock-out conditionnel (inactivation conditionnelle) et le système Cre/Lox. Cette technologie permet d inactiver de façon contrôlée le gène d intérêt dans un organe donné d une souris adulte afin d éviter les problèmes liés aux anomalies que l absence du gène pourrait provoquer au cours du développement de l animal lors d un knock-out classique . Pour parvenir à notre objectif, nous avons réalisé des constructions modifiées des différents gènes SIRT. La particularité de ces constructions consiste à introduire des séquences Lox autour du domaine du gène codant pour la partie catalytique de l enzyme. Les Lox sont des séquences nucléotidiques de 34 paires de bases qui sont excisées par l enzyme Cre-recombinase lors de l inactivation du gène. Les vecteurs contenant les gènes SIRT modifiés ont été électroporés dans des cellules souches embryonnaires (ES) de souris 129/Sv afin de s intégrer au génome par recombinaison homologue. Les clones positifs ont été injectés par la suite dans des blastocystes. Nous avons obtenu ainsi des souris transgéniques pour le gène d intérêt. Ces souris doivent par la suite être croisées avec des souris exprimant une protéine de fusion Cre-ERT sous le contrôle d un promoteur spécifique d un organe donné. La protéine Cre-ERT est une fusion entre la Cre-recombinase et le récepteur aux oestrogènes ayant une affinité élevée pour le ligand tamoxifène. En cas d injection de tamoxifène, il y a activation de la Cre qui induit l inactivation du gène d intérêt à un moment donné de la vie de la souris et permet d étudier ainsi les effets biologiques qui en résultent.A l heure actuelle, les constructions pour les gènes SIRT1-7 ont été réalisées. Nous disposons des souris transgéniques pour le gène SIRT2 floxé et les croisements sont en cours avec des souris transgéniques CMV-Cre-ERT2 (inactivation de SIRT2 dans tous les tissus) et Syn-Cre-ERT2 (inactivation de SIRT2 dans les cellules nerveuses). Les autres constructions ont été électroporées dans les cellules ES et sont en cours d analyse.Partie II: Etude de la fonction du gène Rb dans la différentiation adipocytaire et le métabolisme énergétique.Le gène du rétinoblastome Rb est le premier gène suppresseur de tumeur identifié et a été largement étudié. Son rôle a bien été démontré dans différents processus biologiques tels le contrôle du cycle cellulaire, l apoptose, la prolifération et la différenciation cellulaires. Récemment, des études in vitro ont montré que la protéine pRb avait un rôle important dans la différentiation adipocytaire et qu un déficit en pRb provoque un changement dans le programme de différentiation d adipocytes blancs de souris en adipocytes bruns. Dans notre étude, nous avons utilisé le système Cre-lox pour inactiver spécifiquement le gène Rb dans le tissu adipeux. Soumises à un régime riche en graisses, des souris déficientes en pRb restent maigres par rapport à leurs congénères qui voient leurs poids augmenter de manière significative. L analyse histologique et en microscopie électronique du tissu adipeux blanc (WAT) des souris déficientes en pRb montre une transformation d une partie du WAT en tissu adipeux brun (BAT) avec une augmentation significative du nombre de mitochondries suggérant une activité métabolique élevée. L analyse moléculaire a démontré une augmentation de l expression des gènes impliqués dans la dépense énergétique tels UCP-1, PGC-1a et Dio2. Ceci se traduit physiologiquement par une augmentation de la consommation en O2 et de la production de CO2 démontrant une élévation de la dépense énergétique chez les souris pRb-déficientes. Ces données confirment que l absence de pRb provoque la conversion d une partie du WAT en BAT, un tissu connu pour son rôle actif dans la dépense énergétique. Le gène Rb devient ainsi une cible thérapeutique potentielle dans le but d induire une perte de poids chez les patients obèses.In mammals, the sirtuin family of histone deacetylases (HDACs) family was named after their homology to the yeast Saccharomyces cerevisiae gene Sir2. In yeast, it has been shown that Sir2 mediates the effects of calorie restriction on the extension of lifespan and that high levels of Sir2 activity promote longevity. Like their yeast homologs, the mammalian sirtuins (SIRT1-7) are class III HDACs and require NAD+ as a cofactor to deacetylate substrates such as histones and transcription regulators. Through this activity, sirtuins are shown to regulate important biological processes ranging from apoptosis, adipocyte and muscle differentiation, and energy expenditure to gluconeogenesis. SIRT1, the most studied sirtuin, seems to be implicated in several pathologies such as diabetes, obesity, heart failure and neurodegenerative disorders.The aim of this Ph.D. thesis was to help understand the biological function of SIRT genes through their inactivation in mice in a spatial and temporal controlled manner, using the Cre/Lox technology. This system allows the controlled inactivation of a gene of interest in a given organ of an adult mouse to avoid abnormalities that could occur during the development when using a classical knock-out . We have generated genetically modified constructs for all SIRT genes by introducing 2 LoxP sequences flanking the catalytic domain of the enzyme. LoxP sites are sequences of 34 nucleotides that can be recognized and excised by the Cre-recombinase enzyme. Vectors containing the modified SIRT gene constructs were electroporated in embryonic stem cells (ES) of 129/Sv mice in order to be integrated in their genome by homologous recombination. Positif clones were then injected in blastocysts of C57BL/6J pseudopregnant mice. We obtained transgenic mice for the gene of interest. These mice will be crossed with mice expressing the Cre recombinase fused to a modified estrogen receptor with high affinity for the synthetic ligand tamoxifen, under the control of a cell specific promoter that targets Cre expression in a specific organ or cell type (promoter-Cre-ERT2). After tamoxifen injection, the Cre recombinase is activated and subsequently the SIRT gene of interest will be inactivated in a specific cell type (e.g. adipocytes), whilst its activity remains in other cells, allowing the study of the biological effects that result from such gene inactivation.At present, we have completed the constructs for all SIRT(1-7) genes. We obtained mice with a floxed SIRT2 allele that were crossed with a CMV-Cre-ERT2 and Synapsin-Cre-ERT2 transgenic mice to generate cohorts of double transgenic mice expressing the floxed SIRT2 allele and the Cre-ERT2 either in all cell types or specifically in neurons. Constructs for other SIRT genes have been electroporated in ES cells and the generation of mice is underway.PART 2: Phenogenomics of adipocyte-specific retinoblastoma deficient miceThe role of the tumor suppressor retinoblastoma protein (pRb) has been firmly established in the control of cell cycle, apoptosis, and differentiation. Recently, it was demonstrated that lack of pRb promotes a switch from white to brown adipocyte differentiation in vitro. We used the Cre-Lox system to specifically inactivate pRb in adult adipose tissue. Under a high-fat diet, pRb-deficient (pRbad-/-) mice failed to gain weight because of increased energy expenditure. This protection against weight gain was caused by the activation of mitochondrial activity in white and brown fat as evidenced by histologic, electron microscopic, and gene expression studies. Moreover, pRb(-/-) mouse embryonic fibroblasts displayed higher proliferation and apoptosis rates than pRb(+/+) mouse embryonic fibroblasts, which could contribute to the altered white adipose tissue morphology. Taken together, our data support a direct role of pRb in adipocyte cell fate determination in vivo and suggest that pRb could serve as a potential therapeutic target to trigger mitochondrial activation in white adipose tissue and brown adipose tissue, favoring an increase in energy expenditure and subsequent weight loss.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF