Etude du sous-site S1 de l'aminopeptidase A par modélisation moléculaire et mutagenèse dirigée. Exploration de la spécificité de substrat de cette enzyme

L aminopeptidase A est une glycoprotéine homodimérique intégrale de type II appartenant à la famille des aminopeptidases monozincs. Elle possède deux caractéristiques : elle est activée par le calcium et présente une spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acides qui devient stricte en présence de calcium.L utilisation d inhibiteurs spécifiques et sélectifs de l APA a permis de démontrer que cette enzyme est impliquée in vivo dans la conversion de l angiotensine II cérébrale en angiotensine III. L APA cérébrale se présente donc comme une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l hypertension. Ainsi, la conception de composés capables de franchir la barrière hémato-encéphalique, d inhiber dans le cerveau l APA et de bloquer la conversion de l angiotensine II en angiotensine III, pourraient constituer une nouvelle classe d antihypertenseurs à action centrale. Afin de développer de tels composés, l étude de l organisation du site actif de l APA a été entreprise.L introduction d un atome de calcium dans le modèle 3D a permis de visualiser une poche hydrophile, dans laquelle l atome de calcium est lié par l Asp-213 et l Asp-218. L implication de ces résidus dans la liaison du calcium et dans la spécificité de substrat de l APA a été vérifiée par des expériences de mutagénèse dirigée. L analyse du modèle nous a permis de visualiser, au sein du sous site S1, un autre résidu, la Thr-348, qui semble impliquer dans la spécificité de substrat pour les résidus N-terminaux acide de l APA. La validation du rôle de la Thr-348 a été effectuée par mutagénèse dirigéeAminopeptidase A is a type II integral membrane-bound protease belonging to the zinc metalloprotease family, the zincins. APA pocesses two characteristics: It contains a calcium ion that increases its enzymatic activity and specifically cleaves N-terminal acid residues, that is increased in the presence of calcium. In-vivo, APA converts brain angiotensin II to angiotensin III. However, angiotensin III is one of the effector peptides of the brain renin-angiotensin system and exerts a tonic stimulatory action on the central control of blood pressure. Central inhibition of APA results in a large decrease in arterial blood pressure in spontaneously hypertensive rats, suggesting that APA might constitute a putative therapeutic target for the treatment of hypertension. Introduction of a calcium atom in the 3D model allowed us to visualized an hydrophilic pocket, in which the calcium atom in bound to Asp-213 and Asp-218. The implication of these residues in calcium binding and substrate specificity was studied by site directed mutagenesis studies. The analysis of the 3D model revealed Thr-348, which seems to be implicated in APA substrate specificity. The role of this residue was demonstrated by site directed mutagenesis studies.PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF