Immunodetection of enzymes catalyzing carbonyl reductions (Western blotting)

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Libuše Černá Školitel: PharmDr. Miloslava Netopilová, Ph.D. Název diplomové práce: Imunodetekce enzymů redukujících karbonylovou skupinu (Western blotting) Enzymy redukující karbonylovou skupinu jsou důležité jak pro metabolizaci eobiotik, tak i xenobiotik. Tyto enzymy se dělí na tři nadrodiny : aldo-keto reduktasy (AKR), dehydrogenasy/reduktasy se středně dlouhým řetězcem (MDR) a dehydrogenasy/reduktasy s krátkým řetězcem (SDR). Součástí SDR nadrodiny je i 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa typ 1 (11β-HSD1). Tento enzym je důležitý pro akvitaci steroidního hormonu kortisonu na jeho aktivní formu kostisol, ale podílí se i na přeměně některých xenobiotik, např. protinádorového léčiva oracinu. Redukce karbonylové skupiny oracinu se však kromě 11β-HSD1 účastní i další enzym lokalizovaný v mikrosomální membráně. Při purifikaci tohoto neznámého enzymu byla použita separace na Q Sepharose. Cílem práce bylo pomocí imunodetekce (Western blotting) zjistit, v kterých frakcích po separaci se vyskytuje 11β-HSD1. Pro Western blotting byla použita nitrocelulózová membrána, primární polyklonální králičí protilátky proti 11β-HSD1 v ředění 1:1000, sekundární polyklonální protilátka s navázanou křenovou peroxidasou v...Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Libuše Černá Supervisor: PharmDr. Miloslava Netopilová, Ph.D. Title of diploma thesis: Immunodetection of enzymes catalyzing karbonyl reductions (Western blotting) The enzymes which reduce carbonyl group are important for metabolism of eobiotics and xenobiotics. There are recognized three superfamilies of carbonyl- reducing enzymes: aldo-keto reductases (AKR), the medium-chain dehydrogenases/reductases (MDR) and the short-chain dehydrogenases/reductases (SDR). The 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11β-HSD1) is member of the SDR superfamily. This enzyme is essential for activating steroid hormone cortison to its active form cortisol. Its activity is also vital for metabolism of some other xenobiotics, e.g the anticancer drug oracin. Yet the carbonyl group of oracin is also reduced by another unknown enzyme wich is located in microsomal membrane. For the purification of this unknown enzyme Q Sepharose was used. The aim was to find out which fractions after purification contain 11β-HSD1 by using the imudetection (Western blotting). In Western blotting we used nitrocelulose membrane, the primary rabbit polyclonal antibodies against 11β-HSD1 dilution 1:1000, the secondary polyclonal...Department of Biochemical SciencesKatedra biochemických vědFaculty of Pharmacy in Hradec KrálovéFarmaceutická fakulta v Hradci Králov