Parvoviral genomes in human soft tissues and bones over decades

Some viruses can establish life-long persistence in their hosts after primary infection. The main aims of this thesis were to investigate the persistence, molecular epidemiology, and evolution of human parvovirus B19 (B19V). B19V is a small single-stranded DNA virus that has been shown to persist in various human soft tissues. The disease associations or mechanisms of this persistence, both at the cellular and molecular level, have remained unknown. At the beginning of this thesis work, we developed a quantitative PCR (qPCR) method for the detection, quantification, and differentiation of all three B19V genotypes. The method was shown to be suitable for B19V diagnosis and research both in human body fluids and solid tissue samples. Measurement of the B19V load is essential in i) timing of the primary infection, ii) investigation of the persistence mechanisms, and iii) plasma pool screening in blood product manufacturing. Next, we performed in-depth studies on the B19V persistence in tonsil, bone marrow, and bone. B19V-DNA tissue prevalences were high (35-74 %). Our results were in line with previous publications (tonsils), showed a higher prevalence than earlier detected (bone marrow), and described an entirely new tissue harboring B19V DNA (bone). We described, for the first time, the cell type accounting for the lifelong B19V-DNA tissue persistence in tonsils. Our results showed that B19V persists preferentially in B cells and that the entry mechanism into these cells is antibody-mediated. Antibody-dependent enhancement (ADE) may account for the B19V symptoms during primary infection or play a role in the establishment of persistence. In B cells of four individuals over 45 years, we detected a B19V genotype 2 that had disappeared from circulation before the 1970s. As B19V does not evolve or reactivate within human tissues, these individuals must have carried the genotype 2 virus in their B cells for over 40 years, suggesting a survival time of several decades for these B cells. Indeed, immunological memory may be, in addition to antigen re-exposure, due to a decades-long survival of the original B cell clones. In addition to persistence, we investigated in this thesis B19V molecular epidemiology and evolution. We constructed several full-length genomic sequences of B19V genotypes 1 and 2. By combining our bone marrow and bone data, we observed that within an individual, a single B19V genotype is present. We found that the inverted terminal repeat (ITR) sequences, crucial for B19V replication, are similar in both genotypes, and thus, do not explain the disappearance of genotype 2. We searched B19V DNA from long bones of World War II (WWII) casualties and found an astonishingly high prevalence (45 %). This work, for the first time, shed light on the epidemiological occurrence of B19V in Northern Europe between ~1923 and 1944 and laid the foundation for a new research approach: archeovirology, i.e., the study of virus occurrence and evolution via ancient relics. Indeed, we describe in this thesis – first in the world – persistent viral genomes in human bone. In addition to B19V, we investigated the prevalences of altogether 37 human DNA viruses in contemporary femoral bones via qPCR and next-generation sequencing (NGS). We discovered several members of the parvo-, herpes-, papilloma- and polyomavirus families, as well as hepatitis B virus and torque teno virus. Thus, our findings revealed bone to be a much richer source of persistent DNA viruses than ever perceived. Our results show that human skeletal remains – both contemporary and ancient – are suitable material for the investigation of epidemiologies and evolutionary histories of DNA viruses. After our work on WWII bones, archeovirology has expanded: other groups have described B19V, hepatitis B virus, and variola virus sequences in thousands of years old dental and skeletal human remains. Ancient specimens will provide an unforeseen historical perspective on viruses and infectious diseases.Osa viruksista jättää ensi-infektion jälkeen perintöaineksensa eli genominsa pysyvästi isännän kudoksiin. Tätä kutsutaan persistenssiksi, ja se on usein elinikäistä. Tämän väitöskirjan päätavoitteina oli tutkia parvorokkoviruksen persistenssikykyä, molekyyliepidemiologiaa ja evoluutiota. Parvorokkovirus on pienenpieni ihmisen DNA-virus. Sen on osoitettu persistoivan ihmisen pehmytkudoksissa, mutta persistenssin tautiassosiaatiot ja mekanismit, sekä solu- että molekyylitasolla, ovat vielä tuntemattomia. Väitöskirjatyön alussa kehitimme kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktio (qPCR) -menetelmän, joka tunnistaa, määrittää pitoisuuden ja erottelee kaikki kolme parvorokkoviruksen alatyyppiä. Parvorokkovirusmäärän mittaus on tärkeää ensi-infektoiden ajoittamisessa, persistenssimekanismien selvittämisessä ja viruksen seulonnassa verituotteista. Seuraavaksi tutkimme parvorokkoviruksen persistenssiä kolmessa eri kudoksessa: nielurisoissa, luuytimessä ja luussa. Virusgenomien esiintyvyys oli korkeaa (35-74 %). Tulokset ovat yhtenäisiä aiempien tutkimustulosten kanssa (nielurisat), osoittivat korkeampaa esiintyvyyttä (luuydin), ja kuvasivat kokonaan uuden kudoslajin, jossa parvorokkovirus persistoi (luu). Selvitimme nielurisoilla ensimmäisenä maailmassa solutyypin, joka mahdollistaa parvorokkoviruksen persistenssin. Havaitsimme viruksen säilyvän B-soluissa, ja osoitimme, että päästäkseen solun sisään virus hyödyntää elimistömme muodostamia vasta-aineita. On mahdollista, että tämä viruksen vasta-ainevälitteinen kulkeutuminen soluun edistää persistenssin tai oireiden kehittymistä. Lisäksi havaitsimme neljän >45-vuotiaan henkilön B-soluissa parvorokkoviruksen alatyypin 2, jonka tiedetään kadonneen kierrosta 1970-luvulla. Koska parvorokkovirus ei muunnu kudospersistenssin aikana tai kykene uudelleenaktivoitumaan, päättelimme, että nämä henkilöt olivat kantaneet virusta elimistönsä B-soluissa jopa 40 vuotta. Onkin mahdollista, että ihmisen vasta-ainevälitteinen immuunipuolustus perustuu vuosikymmenienkin jälkeen kyseisen patogeenin kohdanneisiin alkuperäisiin B-soluihin. Tutkimme perimätasolla parvorokkoviruksen taudinaiheuttamiskykyä ja evoluutiota. Määritimme usealta henkilöltä parvorokkoviruksen perintöaineen emäsjärjestyksen. Havaitsimme, että kunkin ihmisen eri kudoksissa esiintyy vain yhtä parvorokkoviruksen alatyyppiä. Vertailimme viruksen perintöaineen muodostamia sekundaarirakenteita. Emme havainneet eroja alatyyppien 1 ja 2 välillä, joten päättelimme, että sekundaarirakenteet eivät selitä tyypin 2 katoamista. Analysoimme parvorokkoviruksen perintöainesta myös toisen maailmansodan sotavainajien luista. Tämä työ selvensi parvorokkoviruksen esiintyvyyttä noin vuosien 1923-1944 välisenä aikana Pohjolassa ja synnytti aivan uuden tutkimussuuntauksen, arkeovirologian, jossa virusten esiintyvyyttä ja evoluutiota on mahdollista selvittää analysoimalla muinaisia ihmisjäänteitä. Kuvaammekin tässä väitöskirjassa – ensimmäisenä maailmassa – persistoivia virusgenomeja ihmisen luussa. Selvitimme, parvorokkoviruksen ohella, yhteensä 37 DNA-viruksen esiintyvyyttä nykyihmisten reisiluissa qPCR- ja massiiviparalleelisekvensointimenetelmillä. Löysimme ennennäkemättömän suuren määrän viruslajeja mukaan lukien useita parvo-, herpes-, papillooma- ja polyoomaviruksia, sekä hepatiitti B viruksen ja TT-viruksen. Tuloksemme kertovat ihmisluiden – sekä tuoreiden että ikivanhojen – soveltuvan erinomaisesti virusten molekyylitason epidemiologian ja evoluution tutkimiseen. Sotavainajatutkimuksemme jälkeen viruslöydöksiä onkin julkaistu jopa tuhansia vuosia sitten eläneiden ihmisten hampaista ja luista. Ihmisluut voivatkin tulevaisuudessa mullistaa virusten ja infektiotautien historian tutkimuksen