Rôle des glutarédoxines dans la tolérance aux stress oxydant et métalliques chez Synechocystis

Le maintien de l'homéostasie rédox des thiols, dépendant du pouvoir réducteur du NADPH, est un processus vital pour la cellule faisant intervenir deux voies supposées distinctes : 1) thiorédoxine réductase/thiorédoxines et 2) glutathion réductase/glutathion/glutarédoxines. En dépit de leur importance, on connaît mal la spécificité des glutarédoxines et des thiorédoxines [1]. C est particulièrement vrai chez les organismes photosynthétiques, dont le métabolisme rédox, dépendant de la photosynthèse, est essentiel à la biosphère (production d'oxygène, assimilation du carbone et de l'azote inorganiques nécessaires à la production de biomasse pour la chaîne alimentaire). La photosynthèse, comme la respiration, produit des molécules oxydantes (les espèces activées de l'oxygène) qui perturbent, entre autres, l'homéostasie rédox des thiols. Dans le cas des glutarédoxines, il a été montré, chez les organismes hétérotrophes, que ces enzymes utilisent le pouvoir réducteur du glutathion (re-réduit par le NADPH via la glutathion réductase) pour contrôler l'état rédox des thiols des résidus cystéines (Cys) des protéines (réduire les ponts disulfure inter- ou intra-moléculaires). Les glutarédoxines se répartissent en deux grandes familles, selon la composition de leur centre rédox actif: les glutarédoxines à dithiol (possédant un site actif de type CysXXCys) et les glutarédoxines à monothiol (avec un site actif de type CysXXSer). Au cours de ma thèse, j ai analysé, in vitro et in vivo, les glutarédoxines avec un organisme photosynthétique modèle: la cyanobactérie unicellulaire Synechocystis PCC6803 (Synechocystis), qui possède un petit génome (3,57 Mb) entièrement séquencé et génétiquement manipulable avec les vecteurs plasmidiques développés au laboratoire. Synechocystis possède 3 glutarédoxines (Grx): deux à dithiol (Grxl et Grx2) el une à monothiol (Grx3). Dans un premier temps, j'ai inactivé les 3 gènes correspondants, indépendamment ou non. Tous les mutants correspondants (simples, doubles el triple) sont parfaitement viables, dans les conditions standard de croissance. Par contre, leur tolérance aux stress diffère de celle de la souche sauvage. Le mutant grxl est sensible au mercure (HgCl2) et à l'uranium ((CH3COO)2UO2). Le mutant grxl est sensible au peroxyde d'hydrogène (H2O2), au cadmium (CdSO4) et au sélénate (NaSeO4). Le mutant grx3 est sensible au bleu de méthylène. Le triple mutant grxl grx2 grx3 est sensible à chacun des toxiques précédemment cités, et aussi, de façon spécifique par rapport aux autres mutants, à un excès (x25) de zinc (ZnCl2), Ces résultats indiquent que les Grx possèdent une certaine sélectivité, qui s'exerce vraisemblablement au travers d'interactions spécifiques. Pour rechercher des partenaires protéiques des Grx, j'ai utilisé un système bactérien de "double hybride", basé sur 2 plasmides dans lesquels on peut cloner, indépendamment, les gènes codant pour les protéines "appâts" (chacun des trois gènes grx) et les protéines "proies" (les partenaires possibles des Grxs). Pour identifier ces dernières, nous avons cloné, indépendamment, une cinquantaine des gènes impliqués dans métabolisme rédox, sans se limiter au contrôle de l'homéostasie rédox des thiols. Les 1000 tests d'interaction réalisés nous ont permis d'identifier 10 interactions totalement nouvelles impliquant des Grx. Ensuite, j'ai analysé les interactions (1) Grxl-MerA (MerA est la réductase du mercure) et (2) thiorédoxine réductase-GrxI-Grx2, par une approche multidisciplinaire: (i) mutagenèses dirigées, tests double hybride et études in vivo; (ii) approche biochimique (GST Pulldown); et (iii) tests d'activité in vilro. J'ai montré que l'activité de réduction du mercure de MerA est inhibée, de façon réversible, par la glutathionylation (fixation d'une molécule de glutathion) d'une cystéine (Cys78) de son site actif. Grxl réactive MerA en catalysant la réaction de déglutathionylation du site actif de MerA. Outre la tolérance de Synechocystis au mercure (HgCl2), j'ai montré que Grx1 et MerA interviennent également dans la résistance à l'uranium (CH3COO)2U02. Parallèlement, j'ai analysé les interactions thiorédoxine réductase-Grxl-Grx2. J'ai montré que la thiorédoxine réductase est capable de réduire Grxl, qui peut à son tour réduire Grx2. Cette voie rédox originale compense j'absence de glutathion réductase chez Synechocystis. J'ai également montré que cette "nouvelle" voie rédox est capable de réduire le sélénate. Ces résultats in vitro sont confortés par certains de mes résultats qui suggèrent que Synechocystis répond au sélénate par la formation d'un hétérodimère Grxl-Grx2. Les deux "nouvelles" voies rédox caractérisées au cours de ma thèse sont particulièrement intéressantes car elles permettent de relier deux processus rédox, homéostasie rédox des thiols et détoxication des métaux lourds par réduction, qui n'étaient jusqu'ici pas considérés comme étant étroitement imbriqués.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF