Synthèse et évaluation de nouveaux analogues nucléosidiques dirigés contre le VIH-1 (Etude d'un mécanisme d'action original)

La résistance du virus de l immunodéficience humaine (VIH) aux différents traitements antiviraux est un défi majeur pour la lutte contre le SIDA qui nécessite la recherche permanente de nouvelles solutions thérapeutiques. Selon la théorie du seuil catastrophique d erreur, une légère augmentation du taux de mutation du virus pourrait mener à l arrêt de la réplication virale par mutagenèse létale. Notre but est de déterminer la validité de ce concept et d aller vers la découverte de nouveaux agents antiviraux actifs contre les souches du VIH-1 résistantes aux traitements actuels. Plusieurs nucléosides judicieusement modifiés sur leur base hétérocyclique ont été synthétisés et évalués. Des fonctions susceptibles de favoriser des appariements multiples ont été introduites sur des analogues de la désoxyadénosine, de la désoxyuridine et de la désoxycytidine. Une méthode de synthèse et de purification de nucléosides 5 -triphosphates est également décrite. Enfin, des oligonucléotides contenant quatre des nucléosides modifiés ont été synthétisés et purifiés. La stabilité des appariements formés par les nucléosides modifiés avec les nucléosides naturels a été évaluée par des tests de température de fusion. Un des composés testés s est avéré intéressant, car il forme des appariements relativement stables avec deux nucléosides naturels différents. Une fois incorporé dans l ADN viral, cet analogue pourrait générer des mutations en s appariant avec plusieurs nucléotides sans grande sélectivité. Des essais de cristallogenèse associés à la cristallographie ont permis d obtenir des clichés de diffraction des rayons X de duplexes contenant un nucléoside modifié et pourraient permettre de visualiser son appariement avec plusieurs nucléosides naturels. Des expériences in vitro ont été réalisées pour mesurer l efficacité d incorporation par la RT des différents nucléotides naturels face aux nucléotides modifiés synthétisés. Un des composés synthétisés s est révélé être intéressant, car il permet à la RT d incorporer deux nucléotides naturels dans le brin complémentaire, tout en poursuivant l élongation. Les nucléosides modifiés ont également été testés en culture cellulaire pour une mesure de leur effet antiviral et de leur cytotoxicité. Une expérience réalisée sur plusieurs passages du VIH en culture cellulaire nous a permis de déterminer si ces nucléosides sont incorporés dans l ADN viral et s ils provoquent des mutations. Deux composés ont un effet sur la réplication virale dans les tests standards avec une IC50 de l ordre de 20􀀁M, alors que lors de huit passages successifs du virus en culture cellulaire, deux composés inhibent la réplication virale et pourraient agir en tant que mutagènes.Drug resistance is an important challenge in the treatment of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection that requires continuous efforts to develop new therapeutic options. According to the theory of Viral Error Catastrophe, even a slight increase in the mutation rate could push the virus beyond the error threshold for viability of the viral population. Our goal is to validate this approach and to make a step towards the discovery of new antiviral drugs active against drugresistant HIV-1 strains. To this aim, we designed several modified nucleosides. We describe here the synthesis and evaluation of those modified nucleosides, bearing functional groups on their base moiety engineered to favor alternative base-pairings. The synthesis and purification of a modified nucleoside 5 - triphosphate is also described. Finally, we report the synthesis and purification of oligonucleotides containing four of our modified nucleosides . The stability of the base pairs formed by a modified and a natural nucleoside has been compared by measuring the melting temperature of duplexes containing our modified nucleosides. One of the four modified nucleosides tested appeared promising in this assay, as it formed base pairs of similar stability with two natural. Once incorporated into viral DNA, this compound could create mutations by pairing with several natural nucleotides with low selectivity. Crystallogenesis assays combined with crystallography allowed us to collect X-ray diffraction data of duplexes containing one modified nucleoside. Further study of these crystals should allow us to gain insight into the structure of the base-pairs involving this nucleoside. In vitro incorporation experiments were performed in order to measure the incorporation efficiency of natural nucleotides in front of the modified nucleotides. Again, one compound appeared promising as two natural nucleotides were efficiently incorporated in front of it, without preventing incorporation of the next incoming nucleotide by reverse transcriptase. In a standard cell culture assay, two modified nucleosides showed a moderate activity against HIV replication (IC50 20􀀁M). When tested over eight sequential passages of virus in cell culture, two compounds showed a progressive and reproducible inhibition of viral replication that may be attributed to lethal mutagenesis.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF