Mutations des éléments cis-régulateurs de l'épissage (rôle en pathologie humaine)

L'épissage des ARN pre-messagers joue un rôle fondamental dans l'expression des gènes chez les eucaryotes supérieurs. La régulation de ce processus extrêmement complexe, qui permet l'excision des introns, repose sur la reconnaissance de multiples éléments, incluant les séquences consensus (sites accepteurs et donneurs) et cis-régulatrices auxiliaires, dont la combinaison définit un "code de l'épissage" propre à chaque exon. Les exemples de mutation associées à des anomalies d'épissage dans les maladies génétiques humaines sont de plus en plus nombreux, néanmoins leur contribution reste très probablement sous estimée. En effet, un nombre important de variants non classés (Unknown Variants, UVs) introniques ou exoniques est identifié par séquençage des gènes, dont une partie est susceptible d'altérer l'épissage. Quand les transcrits spécifiques des patients ne sont pas accessibles, l'utilisation combinée d'outils bio-informatiques et de tests fonctionnels basés sur l'utilisation de minigènes rapporteurs d'épissage permet d'évaluer l'impact de ces UVs sur l'épissage. Cette stratégie, appliquée aux variants identifiés dans les gènes responsables du syndrome de Usher, a montré que 76% des UVs localisés à des positions peu conservées des sites consensus avaient des conséquences majeures sur l'épissage. Au cours de ces travaux, nous avons confirmé l'importance de l'interdépendance des positions nucléotidiques dans la définition des sites d'épissage, et avons pu établir que les positions -1 et +4 du site donneur d'épissage permettaient de compenser un mésappariement en position +3 avec la protéine U1 snRNP. Les évènements d'épissage alternatifs jouent également un rôle important dans la modulation de sévérité du phénotype en pathologie humaine. On observe ainsi pour le gène DMD (Duchenne muscular Dystrophy) que des mutations non-sens (introduisant un codon stop prématuré) sont retrouvées dans des formes modérées de la maladie (Myopathie de Becker) lorsqu'elles sont à l'origine d'un épissage alternatif en phase de l'exon muté. L'identification des éléments cis-régulateurs de l'épissage impliqués (ou SREs, splicing regulatory elements), notamment les séquences activatrices de type ESE (Exonic Splicing Enhancer), représente un enjeu majeur pour la mise en place des stratégies thérapeutiques par saut d'exon dans la myopathie de DuchenneSplicing of pre-messenger RNAs to mature transcripts is a crucial step in eukaryotic gene expression. This highly regulated mechanism involves multiple signals, including the core splice site motifs (donor and acceptor splice sites) and auxiliary ci-regulatory elements, which are part of integrated "splicing code". More and more examples of splicing mutations resulting in genetic diseases are described in the literature, however their true contribution is probably underestimated. Indeed, sequence-based approach to study disease-causing genes in diagnostic procedures leads to the identification of an increasing number of variants of unknown significance (UVs). The biological consequences of the so-called UVs and notably their purative impact of splicing ar unknown. When specific analysis is not achievable in patients, in silico predictions associated with minigene studies are performed to determine the impact of these UVs on splicing. This strategy was applied to a set of UVs located in poorly conserved positions of acceptor and donor splice sites of Usher genes, and 76% of them were found to cause aberrant splicing. From our results, we further confirmed the importance of the overall nucleotidic environment in splice sites selection. In particular, we could establish that positions -1 and +4 in donor splice sites can compensate a mismatch at position +3 with the U1 snRNP and contribute to the correct recognition of such donor splice sites. Alernative splicing events play also a major role in modulation of disease severity. In the DMD gene, nonsense mutations introducing a premature stop codon are found in patients with a milder phenotype (Becker-like) than expected (Duchenne-like), and usually result from the elimination of the truncating mutation from dystrophin mRNA by skipping of an in-frame exon. This kind of disease-causing mutations can contribute to shed light on new cis-regulatory elements, in particular Exonic Splicing Enhancer (ESE) motifs, essential for splicing in the DMD gene, which may be important for the exon skipping therapeuric strategyMONTPELLIER-BU Médecine UPM (341722108) / SudocMONTPELLIER-BU Médecine (341722104) / SudocSudocFranceF