Conception et caractérisation de biocapteurs basés sur l'association de récepteurs et canaux ioniques

Les canaux sensibles à l'ATP (KATP) résultent de l'association unique d'une protéine ABC (le récepteur des sulfonylurées, SUR) et d'un canal potassique rectifiant entrant (Kir6.x). Suite à la liaison de divers effecteurs (nucléotides, molécules pharmacologiques), SUR module l'activité de Kir6.x. Dans l'organisme, les canaux KA TP lient le niveau énergétique de la cellule au potentiel membranaire. De ce fait, leur implication dans diverses fonctions physiologiques telles que la sécrétion pancréatique d'insuline ou le contrôle du tonus vasculaire en fait des cibles thérapeutiques. Ainsi, dans le cadre d'une collaboration, nous avons testé des composés (dérivés benzothiazine) sur le canal KATP. Quatre d'entre eux se sont avérés être des ouvreurs des canaux KATP. Nous avons également exploré l'effet de deux insecticides, l'amitraz et le diflubenzuron sur le canal KATP. En outre, dans une optique de généralisation du concept d'Ion Channel-Coupled Receptor (ICCR) mis au point par l'équipe, nous avons élaboré des biocapteurs reposant sur l'assemblage de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et Kir6.2. Cette association, inspirée par le canal KATP, est réalisée de telle manière que la fixation d'un ligand sur le GPCR entraîne la modulation de l'activité de Kir6.2. L'ingénierie moléculaire nous a permis de fusionner Kir6.2 aux récepteurs t3J. adrénergique, dopaminergique D3, cannabinoïde 1 (CBl), des CC-chimiokines 2 et à l'opsine. La méthode de double-microélectrodes nous a permis d'identifier trois ICCR fonctionnels basés sur les récepteurs t3J., D3 et CBl. Ce~ biocapteurs présentent des applications dans le cadre du criblage haut débit, la caractérisation fonctionnelle des GPCR Ol la compréhension de la régulation de l'activité de Kir6.2.A TP sensitive potassium channels (KA TP) comprise two proteins: The sulfonylurea receptor (SUR. an ABC protein) and an inward rectifier potassium channel (Kir6.2). Upon binding of different types of effectors (nucleotides, pharmacological compounds), SUR. the regulatory subunit, modulates the gating ofKir6.2. The KATP channel links the metabolic state of the cell to its electrical excitability. Thereby, it acts as a metabolic sensor and is involved in physiological functions such as insulin secretion, cardioprotection, vascular tone control... Thus, the KA TP channel constitutes a therapeutic target. ln this work, we studied the effects ofbenzothiazine derivatives on SURI + Kir6.2 and SUR2A + Kir6.2. We also investigated the effects oftwo pesticides, amitraz and diflubenzuron on the KATP channel. To extend the concept ofIon Channel-Coupled Receptor (ICCR) initiated in the laboratory, we designed new constructs by engineering fusion between Kir6.2 and five GPCRs: the t3J. adrenergic, cannabinoid 1 (CBl), dopaminergic D3, CC chemokine (CCR2) receptors and opsin. The receptor C-ter and Kir6.2 N-ter extremities were pared to promote efficient coupling and joined covalently. The fusions were heterologously expressed in Xenopus oocytes and characterized by the two-electrode voltage clamp technique. Three ICCR t3J. adrenergic-basecl, CBl-based and D3-based) out of five were shown to be functional. Thus, the ICCR concept is readily applicable to class A GPCRs. Besides their obvious interest in drug screening, the new ICCRs should be valuable tools to investigate the intermolecular events involved in the modulation of Kir6.2 gating and the nature of the GPCR conformational changes evoked by their ligands.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF