Isolation of lactococcus lactis subsp. lactis and lactococcus lactis subsp. cremoris strains from traditionally made izmir tulum cheese and identification of isolates by phenotypic and molecular techniques

Bu çalışma, starter kültür kullanılmadan geleneksel tekniklere göre yapılmış İzmir Tulum peynirinden Lactococcus cinsine ait suşların izolasyonu ile bu izolatların birtakım fenotipik testler yardımıyla ve 16S rDNA baz alınarak düzenlenmiş primerler ile polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak identifiye edilmesi amacıyla yapılmıştır. Elde edilen izolatlar, hem gelecekte bilimsel çalışmalarda materyal olarak kullanılacak, hem de peynircilikte potansiyel kültür olarak kullanılabilecektir. Bu amaçla, Mayıs 2005 ile Mayıs 2006 tarihleri arasında 90 tane peynir örneği Aydın İli ve çevresinden toplanmıştır. Peynir örneklerinin soğuk zincir altında laboratuvara taşınmasından sonra mikrobiyolojik ekimler gerçekleştirilmiştir. Laktokok suşlarının izolasyonunda 40 µg/ml nalidiksik asit içeren M17 agar kullanılmıştır. Bu besi yerindeki koloni sayılarının 1.9 x 107 ile 2.1 x 108 kob/g düzeyleri arasında değiştiği tespit edilmiş, tipik özellik gösteren koloniler ileri işlemler için seçilmiştir. Bu amaçla bu özellikteki suşlar, M17 laktoz broth içeren tüplere aktarılmış ve 30oC’de 24 saat inkübe edilmiştir. Üreyen mikroorganizmalar yeniden M17 agar besi yerine ekilmiştir. Bu süreç izolatların saflaştırılması amacıyla 2 kez gerçekleştirilmiştir. Bu işlemlerden sonra izolatlar biyokimyasal testlere tabii tutulmuşlar ve bu şekilde 36 izolatın laktokok profili gösterdiği tespit edilmiştir. Daha sonra bu izolatların lactis ya da cremoris alt türlerine ait olup olmadıklarını belirlemek amacıyla alttürlere spesifik primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile analiz edilmiştir. Test edilen izolatların 18 tanesi lactis primerleri ile 11 tanesi de cremoris primerleri ile pozitif sonuç vermiştir. Test edilen primerlerden hiçbirisi diğer türe ait mikroorganizmalarla pozitif sonuç vermemiştir.This study was done to isolate strains belonging to the Lactococcus genus from Izmir Tulum cheese manufactured according to traditional techniques without using starter bacteria and to identify the isolates by some phenotypic tests and polymerase chain reaction by using primers designed from 16S rDNA. The isolated strains would be used for scientific studies in the future and selected possible candidates would be employed as starter culture in the cheese making. For this purposes, 90 cheese samples were collected from Aydın province between May 2005–May 2006. Cheese samples were transported to the laboratory in appropriate conditions and subjected to microbiological analyses. M17 agar containing 40 µg/ml was used as the media for the isolation of lactococcal strains. The number of colonies growing on the media was found to vary from 1.9 x 107 to 2.1 x 108 cfu/g. A typical colony representing the appearance of type strain was selected for the further identification. For this purpose the colonies were picked up and transferred into M17 lactose broth and incubated at 30 C for 24 h. Thereafter, planting onto M17 agar was performed. This process was repeated twice to allow purification of isolates. After this process the isolates were subjected to biochemical tests and 36 isolates represented lactococcus profile. The isolates were then analyzed by polymerase chain reaction (PCR) by using subspecies-specific primers distinguishing lactis and cremoris subspecies. Among the tested isolates 18 gave positive result with lactis primers whereas only 11 isolates were confirmed by cremoris primers