Interactions moléculaires au cours de l élaboration de la mésostructure de la micelle de caséines ( exploration in vivo et in vitro)

La structure de la micelle de caséines détermine les caractéristiques fonctionnelles de la fraction protéique du lait et conditionne sa transformation industrielle. Cependant, la structure micellaire n'est pas élucidée. De nombreuses interrogations subsistent concernant l'agencement des caséines dans la micelle, l'existence ou non d'associations privilégiées, les interactions entre les caséines et la fraction minérale, et le rôle de chacun de ces composants dans le processus d'élaboration de cet édifice supramoléculaire. L'objectif de notre travail est de comprendre l'arrangement des caséines dans la micelle et le rôle de chacune dans l'élaboration intracellulaire de cette structure. La stratégie adoptée est donc d'étudier la formation de la micelle de caséines dans la voie de sécrétion de la cellule épithéliale mammaire (CEM). Dans un premier temps, nous avons choisi de caractériser l'état d'agrégation des caséines dans le premier compartiment de la voie de sécrétion, le réticulum endoplasmique rugueux. L'essentiel des expériences a été réalisé sur les caséines du tissu mammaire de rat et nous avons confirmé notre modèle chez un ruminant, la chèvre. Des fractions purifiées de microsomes rugueux, issues du RER du tissu mammaire, ont été perméabilisées par de la saponine dans des conditions conservant ou non la structure micellaire. L'analyse du comportement des caséines immatures des microsomes en conditions conservatives montre que la caséine ne semble pas agrégée dans ce compartiment alors qu'une forte proportion de la caséine S1 reste associée aux microsomes. Les extractions membranaires dans différentes conditions physico-chimiques ont révélé l'existence d'une forme membranaire de la caséine S1 dans les microsomes rugueux mais également dans des compartiments plus tardifs de la voie de sécrétion. De plus, nous montrons que les ponts disulfure intermoléculaires jouent un rôle important dans la liaison de la caséine S1 avec les membranes. Pour caractériser les bases moléculaires de l'interaction de la caséine S1 avec les phospholipides des membranes biologiques, nous avons mis en oeuvre des techniques spectroscopiques. Les formes phosphorylée et déphosphorylée de la caséine S1 purifiée à partir de lait de rat ont été placées en présence de liposomes de différentes tailles (SUVs et LUVs). La fluorescence intrinsèque du tryptophane révèle des modifications conformationnelles pour la caséine S1 déphosphorylée et des changements structuraux ont été mis en évidence par dichroïsme circulaire, pour les deux formes de la protéine lors de la liaison avec les phospholipides des vésicules lipidiques.The structure of the casein micelle determines the functional characteristics of the milk protein fraction and has an impact on food processing. However, the intrinsic organisation of this structure has not been fully established. Many questions remain about the specific arrangement of the caseins in the micelle, the existence of not of privileged associations, the interactions between caseins and the mineral fraction and the role of individual component in the aggregation process. The objective of this thesis was to understand the specific arrangement between caseins in the micelle and the role of the individual casein in the development of the micellar structure in the cell. With this aim, we studied the formation of casein micelle within the secretory pathway of mammary epithelial cell (MECs). We chose, inititially, to characterize the state of aggregation of the caseins in the first compartment of the secretoy pathway, the rough endoplasmic reticulum (RER). First, we study the caseins of rat mammary tissue and we then wished to generalize our observations to a ruminant, the goat. Rough ER microsomal fraction purified from rat mammary gland cells was permeabilized with saponin, in conservative or non conservative conditions for casein micelle structure. From our analysis in conservative conditions, we concluded that immature !-casein contained in rough microsomes was at most weakly associated with primary casein aggregates whereas the majority of immature S1-casein remained associated to microsomes. Membrane extraction in different physico-chemical conditions demonstrated that a fraction of S1-casein exists as a membrane-associated form within rough microsomal vesicles and in more distal compartments of the secretory pathway. Furthermore, our results indicated a key role of dimerization via disulphide bonds in the interaction of the protein with membranes. To characterize the molecular basis of the interaction of S1-casein with the phospholipids of the biological membranes, we used spectroscopic methods. The phosphorylated and unphosphorylated S1-casein, purified from rat milk, was placed in the presence of liposomes of different types (LUVs and SUVs). Fluorescence measurements revealed conformational changes for the unphosphorylated S1-casein and circular dichroïsm displayed structural changes during interaction between the two forms of the protein and the phospholipids of lipid vesicles.RENNES-Agrocampus-CRD (352382323) / SudocSudocFranceF