Etude de la voie de biosynthèse du folate (caractérisation biochimique et recherche d'inhibiteurs de la formation de l'acide para-aminobenzoïque)

Le terme folate (vitamine B9) désigne une famille de molécules ayant une structure de base composée de 3 parties : un noyau pterine, un acide para-aminobenzoïque (pABA) et une chaine de glutamates. Le rôle de ces cofacteurs est de transporter des groupements monocarbonés. Ils interviennent dans de nombreuses réactions comme la synthèse des bases nucléiques, la synthèse de méthionine et la synthèse et le turnover de la S-adenosylmethionine,. Le folate est synthétisé chez les plantes et un grand nombre de micro-organismes dont les parasites du phylum des apicomplexes, tels que Plasmodium falciparum, et Toxoplasma gondii. Les enzymes impliquées dans cette voie de biosynthèse étant absentes chez l'homme, elles représentent des cibles herbicides, antibiotiques et antiparasitaires potentielles. Les inhibiteurs de la voie de biosynthèse du folate (tels que les sulfamides, analogues du pABA et inhibiteurs de la dihydroptéroate synthase, ou les inhibiteurs de la dihydrofolate réductase), sont souvent utilisés comme antibiotiques et antiparasitaires. Un problème majeur dans le traitement de ces maladies infectieuses est la résistance développée contre ces molécules, ce qui nécessite la recherche permanente de nouveaux médicaments. Le pABA est synthétisé en plusieurs étapes qui sont autant de cibles intéressantes pour développer de nouveaux inhibiteurs. Tout d'abord l'aminodeoxychorismate (ADC) synthase transforme le chorismate en ADC, puis dans une seconde étape, l'ADC est transformé en pABA par une ADC lyase. Chez les plantes supérieures et les parasites apicomplexes l'ADC synthase est une enzyme bifonctionnelle composée de deux grands domaines, un domaine glutamine amidotranferase (GAT) qui permet de produire le NH3 nécessaire à l'amination du chorismate, et un domaine ADC synthase (ADCS). Nous avons pu déterminer les paramètres cinétiques de la GAT-ADCS d'Arabidopsis. Nous avons constaté que ces deux domaines fonctionnent indépendamment, c'est-à-dire soit en présence de glutamine seule pour le domaine GAT (pas de chorismate), soit en présence de chorismate et de NH3 pour le domaine ADCS (pas de glutamine). Toutefois, le fonctionnement en tandem des deux domaines (tous les substrats sont présents) améliore les propriétés cinétiques (kcat) de chacun d'eux. Nos résultats montrent aussi que le NH3 produit par le domaine GAT et nécessaire à la synthèse de l'ADC n'est pas relargué dans le milieu extérieur mais canalisé (channeling) vers le domaine ADCS. Finalement, nous avons observé que l'ADC, produit final de la réaction, retro-inhibe le domaine ADCS en absence d'ADC lyase. Pris dans son ensemble, nos résultats indiquent que l'amination du chorismate est l'étape la plus limitante de la synthèse du pABA,.. Des expériences de criblage à haut débit nous ont permis d'identifier une molécule, la rubreserine, qui inhibe in vitro le domaine GAT de l'ADC synthase d'Arabidopsis avec un Ki autour de 8 M. Nous avons observé que cette molécule inhibe la croissance de plantules d'Arabidopsis thaliana et la prolifération des parasites Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum avec des IC50 respectif de 65 M, 20 M et 1.2 M. Chez Arabidopsis, la concentration en folate des cellules traitées est abaissée d'environ 40% par rapport au contrôle, une diminution qui n'a plus lieu en présence de pABA. L'ajout de pABA et de 5-formyltetrahydrofolate dans les milieux de culture d'Arabidopsis ou de Toxoplasma supprime en grande partie l'inhibition de croissance liée à la rubreserine, ce qui montre bien la connexion entre rubreserine et voie de biosynthèse du folate. Avec Toxoplama gondii, la rubreserine apparait plus efficace que les sulfamides pour bloquer l'invasion et la prolifération de ces parasites dans les fibroblastes humains. Ces résultats valident la GAT-ADCS comme cible anti-folate et montrent que la rubreserine a des propriétés anti-parasitaires intéressantes.The term folate (vitamin B9) is a family of molecules with a basic structure composed of 3 parts: a core pterin, a para amino benzoic acid (PABA) moiety and a chain of glutamate. The role of these cofactors is to carry one-carbon groups. They are involved in many reactions such as the synthesis of nucleic acids, the synthesis of methionine and the synthesis and turnover of S-adenosylmethionine. Folate is synthesized in plants and many micro-organisms including parasites of the Apicomplexa phylum such as Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii. Several enzymes involved in the pathway are absent in humans, and so they are potential targets for herbicide, antibiotic and antiparasitic drugs. Inhibitors of folate biosynthesis (such as dihydropteroate synthase inhibitors, or inhibitors of dihydrofolate reductase), are often used as antibiotics and pesticides. A major problem in treating these infectious diseases is the resistance developed against these molecules, which requires a constant search for new drugs. pABA is synthesized in several steps which are all attractive targets for developing new inhibitors. First the aminodeoxychorismate (ADC) synthase converts chorismate into ADC, and then, in a second step, the ADC is converted to pABA by an ADC lyase. In higher plants and apicomplexan parasites the ADC synthase is a bifunctional enzyme composed of two main domains: a glutamine amidotranferase (GAT) domain that produces NH3, and an ADC synthase domain (ADCS) that catalyzes the amination of chorismate. We determined the kinetic parameters of the Arabidopsis GAT-ADCS. We found that these two domains function independently, that is to say either in the presence of glutamine alone for the GAT domain (no chorismate) or in the presence of chorismate and NH3 for the ADCS domain (no glutamine). However, the tandem operation of the two domains (all substrates are present) improves the kinetic properties (kcat) of each one. Our results also show that the NH3 produced by the GAT domain and required for the synthesis of ADC is not released into the surroundings but rather channeled to the active site of ADCS. Finally, we observed that ADC, the final product of the reaction, retro-inhibits the ADCS domain in the absence of ADC lyase. Taken together, our results indicate that the amination reaction of chorismate is the most limiting step of the synthesis of pABA. Using high-throughput screening approaches we have identified a molecule, rubreserine, which inhibits in vitro the GAT domain of Arabidopsis GAT-ADCS with a Ki value around 8 M. We observed that this molecule inhibits the growth of Arabidopsis thaliana seedlings and the proliferation of Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum parasites with respective IC50 of 65 M, 20 M and 1 M. In Arabidopsis, the concentration of folate in rubreserine-treated cells is lowered by about 40% compared to controls, a decrease that is suppressed in the presence of pABA. The addition of pABA and 5-Formyltetrahydrofolate in the culture media of Arabidopsis and Toxoplasma partly reverses the growth inhibition due to rubreserine, which shows the connection between the drug and folate biosynthesis. Rubreserine appears more effective than sulfa-drugs to block the invasion and proliferation of Toxoplasma gondii in human fibroblasts. These results validate the GAT-ADCS as an anti-folate target and show that rubreserine has interesting anti-parasitic properties.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF