Recherche et caractérisation de glycosyltransférases impliquées dans la biosynthèse des polysaccharides de la paroi chez Arabidopsis thaliana

La paroi végétale assure des fonctions biologiques majeures définissant la singularité des plantes ; elle est également à l'origine de multiples applications en tant que ressource agro-alimentaire, source de biomatériaux ou encore pour la production de biocarburants. Malgré cette importance fondamentale et pratique de la paroi végétale, la connaissance de sa biosynthèse apparaît à ce jour toujours très limitée. En effet, la faible abondance des glycosyltransférases (GTs) responsables de sa biosynthèse, l'absence de substrat spécifique et les difficultés à obtenir certains nucléotides-sucres nécessaires aux tests enzymatiques, a souvent rendu difficile les approches de biochimie classiques. Cependant, le séquençage de génomes (Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Poplar populus), la création de banques de mutants d'insertion et la classification des activités glycosyltransférases dans la base de données CAZy (www.cazy.org) sont autant d'outils récents ayant permis des avancées significatives vers la compréhension de la biosynthèse de la paroi des végétaux. Le CERMAV a participé à ce type d'avancée en 2009, en publiant une liste de 24 gènes candidats, nommés NGT pour Nouvelles GlycosylTransférases , présentant des signatures caractéristiques des glycosyltransférases. Afin de démontrer l'implication des gènes NGT dans les processus d'édification de la paroi végétale, nous avons développé une approche de génomique fonctionnelle, analysant en parallèle des lignées mutantes d'Arabidopsis altérées pour les gènes NGT et testant l'activité GT de ces protéines exprimées en systèmes hétérologues. Durant mes travaux de thèse j'ai pu caractériser 15 lignées mutantes à l'état homozygote pour 7 des 24 gènes NGT. Ces lignées homozygotes ont été criblées afin de rechercher un phénotype d'altération du développement ou de la composition en sucres de leur paroi qui soit corrélé à l'altération des gènes NGT. Ce travail de criblage a conduit à s'intéresser plus particulièrement aux mutants ngt1-1 et ngt1-2 altérés pour le gène NGT1 (At5g28910). La caractérisation des lignées mutantes ngt1-1 et ngt1-2 a permis de quantifier un phénotype de croissance foliaire réduit de 38%, par comparaison au développement des feuilles de la plante sauvage. Par ailleurs, la caractérisation biochimique de la paroi des mutants a révélé des réductions significatives et quantitatives de l'arabinose, du galactose et du rhamnose dans la paroi des mutants, ainsi que des modifications qualitatives marquées principalement des arabinanes. L'altération des arabinanes a d'ailleurs pu être confirmée par microscopie après immuno-marquage de sections d'hypocotyle de mutants à l'aide des anticorps monoclonaux LM6 et LM13 dirigés contre des épitopes a-1,5-arabinanes. Il a pu être montré également que la complémentation des mutants par une construction 35S::NGT1 permet de restaurer un phénotype sauvage à ces mutants. Par ailleurs, de façon à tester l'activité glycosyltransférase de la protéine NGT1, nous avons réalisé son expression en système hétérologue. A ce jour, malgré des résultats préliminaires encourageants, il n'a pas été possible de déterminer des conditions de tests permettant d'observer une activité glycosyltransférase suffisante et reproductible pour la protéine NGT1, que ce soit une activité fucosyltransférase (correspondant à la signature de la séquence du gène) ou bien une activité arabinosyltransférase (correspondant au phénotype biochimique des mutants ngt1).The plant cell wall not only defines the unique biology of the plants but also have practical applications as feedstock for biomaterials and for the production of biofuels. Plant primary cell wall is mainly composed of cellulose, hemicelluloses and pectins. Significant progress has been made recently in identifying the enzymes involved in plant cell wall biosynthesis, but only a handful of those have been involved in pectin biosynthesis. With the aim of identifying new putative glycosyltransferases (GTs), in lab Hansen et al 2009 designed a bioinformatic strategy and identified a new group of 24 genes called NGT for (Novel Glycosyltransferase) which were considered strong candidates for putative glycosyltransferase activities. In order to determine the putative role of these NGT genes in plant cell wall biosynthesis, we designed a functional genomics strategy, analysing in parallel Arabidopsis T-DNA mutant lines and performing heterologous expression of candidate genes. I have characterized 15 homozygous mutant lines among the group of 24 putative NGT genes through PCR. We analysed the homozygous mutants for phenotypic alteration such as dwarfing or organ malformation and found that some of mutant lines have narrow leaves as compared to Wild type plants. In parallel I have carried out the cell wall chemical analysis of 12 homozygous mutant lines and did not get any strong difference in neutral monosaccharide composition. The detailed and complete analysis (chemical, expression and microscopic analysis) of all the above mentioned genes could have been time consuming and an overwhelming work, so I focused on At5g28910 (named NGT1) which harbours a fucosyltransferase peptide signature and on At5g14550 (named P), a gene belonging to the DUF266 gene family. Homozygous T-DNA mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 lines were analyzed and showed a reduced growth phenotype (leaf area). Leaf area was quantified at various development stages using ImageJ, and showed a 38% reduction in mutants. Additionally, biochemical characterization of the cell wall was performed showing a reduction in neutral monosaccharide contents, like arabinose, rhamnose and galactose in mutant cell wall. Furthermore glycosyl linkage analysis of mutant lines ngt1-1 and ngt1-2 has shown that 5-Arabinofuranose (5-Araf) and 3,5-Arabinofuranose (3,5-Araf ) contents were decreased as compared to Wild type Col0 cell wall. These results were also confirmed by immunolabeling of stem cross section of mutant and wild type plants. The complementation of the mutant plants through Agrobacterium transformation resulted in the complete restoration of plant phenotype. Taken together, these data suggest that NGT1 could be an arabinosyltransferase. In order to characterize its biochemical activity, the NGT1 protein was heterologously expressed in Pichia pastoris. The recombinant protein was used to perform in vitro activity tests, but we were unable to demonstrate any neither fucosyltransferase (on the basis of peptide signature) nor arabinosyltransferase activity. In parallel to this study, I contributed to the heterologous expression and characterization of two biochemically characterized Arabidopsis GTs involved in xyloglucan synthesis: the fucosyltransferase (AtFUT1) and xylosyltransferase (AtXT1). I have successfully expressed a truncated and active form of AtFUT1, which represents an essential step for further structural studies that will be undertaken in the lab.SAVOIE-SCD - Bib.électronique (730659901) / SudocGRENOBLE1/INP-Bib.électronique (384210012) / SudocGRENOBLE2/3-Bib.électronique (384219901) / SudocSudocFranceF